【Western-blotting】WB常用的两种染色：考马斯亮蓝和丽春红染色

病理医师

在《【Western-Blotting】干货！WB步骤及经验分享》中笔者提到了SDS-PAGE电泳条件（12%分离胶：80V，40min；120V，60min）和湿转条件（预冷湿转液，100V，60min）。在大多数的WB实验步骤中，电泳和湿转条件都是经验性的，因为实验试剂的厂家、浓度及实验室习惯等条件影响，网络上诸多经验性的实验方法可能并不适用于所有实验室或者实验人员；尤其是新的课题组或者新手实验人员。在此，笔者推荐进行预实验，确定实验步骤的所有时间条件，而预实验中实验条件的确定依赖两种常用的染色方法，即考马斯亮蓝染色（coomassie brilliant blue staining）和丽春红染色（Ponceau S staining）。此外，上述两种染色还能帮助实验纠错，有助于研究人员分析错误出现在哪一步骤。
1、SDS-PAGE胶染色：考马斯亮蓝染色（coomassie brilliant blue staining）
SDS-PAGE胶的染色可用于评估电泳和湿转条件是否合适，最常用的方法是蛋白分离情况。考马斯亮蓝染色又称Bradford法，是 Bradford 于 1976 年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法（【Western-Blotting】蛋白提取与蛋白定量）。考马斯亮蓝染色有G250和R250两种，在酸性条件下，R250和G250可与蛋白质中的精氨酸、赖氨酸和组氨酸（arginine, lysine and histidine）结合；R250与蛋白结合后呈红色-粉红色，G250与蛋白结合呈绿-蓝色。考马斯亮蓝染色具有容易检测、高灵敏度（可检测低至0.5ug/cm²的蛋白）和可逆性染色等特点。
在WB中常对SDS-PAGE进行考马斯亮蓝染色，在电泳结束后进行考马斯亮蓝染色可根据SDS-PAGE胶上条带位置、形状及条带间的间距等推断蛋白分离情况，从而评估电泳条件是否得当及SDS-PAGE制备情况；在湿转结束后进行考马斯亮蓝染色可根据不同位置的条带深浅程度等评估不同分子量蛋白的残余程度，从而评估湿转条件是否足够。
Tips：1、考马斯亮蓝染色因高背景，并不推荐PVDF膜或者NC膜的染色；2、尽管考马斯亮蓝染色可逆，但需要改变染色条件（可能影响SDS-PAGE的稳定性等），因此，SDS-PAGE进行考马斯亮蓝染色后不宜进行下一步的转膜。
2、NC膜/PVDF膜的染色：丽春红染色
NC膜/PVDF膜的染色常用于评估转膜是否充分，最常用的方法是丽春红染色。丽春红染色带负电，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带。因其染色的可逆性（容易被dd水、PBS等洗脱）及反应快速（一般仅需5-10分钟），丽春红染色被广泛应用。一般会根据转膜后SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色（是否有蛋白残余）和NC膜/PVDF膜的丽春红染色（转膜是否充分）综合评估转膜条件是否得当。
tips：为保证实验准确性及为排除抗体原因导致阴性结果，有的研究者习惯在转膜后进行丽春红染色。

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