免疫荧光染色从全流程 protocol，建议收藏

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一. 样本制作

以冰冻切片为例：首先将组织置于多聚甲醛固定过夜，30%蔗糖脱水后用包埋剂于-20℃冷冻台上进行冰冻。

将冷冻好的组织块修平，按照不同的组织调整好预切厚度，脑组织一般贴片厚度为15-25um。切好的片子室温晾干后再进行后续染色处理。

不同的样本预处理方法不同，关于细胞样本制备：贴壁细胞样本基本原理是使细胞生长在合适的固相支持物玻片上，然后进行固定。

二. 荧光染色

根据一抗是否直接带荧光标记，将免疫荧光染色分为直接染色或间接染色。

直接染色法是携带荧光素的抗体直接与标本内的抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物，该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。

实际上在实验室中，我们最常使用的还是间接染色法，先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。

下面以间接染色法为例展开叙述：

实验步骤：
1. 复温复温：取出制作好的样本（短期存放-20℃，长期存放-80℃保存），恢复至室温后，用1xPBS洗涤三次，每次 5 分钟；

2. 抗原修复：用0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）充分浸泡样本，微波炉中低火加热修复，保持微沸状态5 min效果最好；

3. 破膜：用 0.5%Triton X-100( 1xPBS配制 )室温通透20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

4. 封闭：封闭液蛋白的选择原则是与一抗蛋白和目标蛋白种属不同，将非特异性位点结合掉，从而保证后续荧光染色的特异性。

5. 一抗孵育：用抗体稀释液将一抗稀释成目标比例，4℃过夜。

6. 一抗洗脱：第二天将湿盒拿出复温30 min,用1xPBS洗脱三次，每次5min；

7. 荧光二抗：用抗体稀释液稀释荧光二抗，室温孵育2 h,注意避光;

8. 二抗洗脱：用1xPBS洗脱三次，每次洗脱时间可稍长一些；

9. 封片：用含防淬灭的甘油进行封片，按需可以对细胞核用DAPI进行染色；

10. 拍片：晾干片子后，置于显微镜下观察，获取荧光图像。

三、常见问题分析

1. 切片组织一直破碎怎么办？
有可能是组织脱水未完全，在冰冻切片时含有冰晶。切片时就会容易破碎。也有可能是冰冻切片机温度设置过低，而切片厚度又较厚就容易出现样本破碎。

2. 双重染色时不同抗体添加顺序？
由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。

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