流式细胞术

John

1.流式细胞术的概念
是以流式细胞仪作为检测手段的一项快速、精确的，对单个细胞理化特性进行多参数定量或定性分析和分选的新技术。或根据微粒（细胞）的特性进行分选，进而研究其生物学特征和功能。在基础研究和临床检验医学领域已经有了广泛的应用。
2.流式细胞仪的基本结构组成
主要由液流系统（样本由液流系统转到光学系统）、光学系统（分析样本的荧光种类）、电子系统（数据处理，呈现电信号）三部分组成。
样本（细胞，血小板，细菌）加荧光抗体孵育，完成制样。样本在液压的作用下，沿着导管传送到有喷嘴的鞘液管中。在电压刺激下，有鞘液的细胞会逐个通过喷嘴，形成单细胞液流。


在激光和滤光片的作用下，从喷嘴喷出的带荧光的细胞，会产生发射光，被荧光检测器捕获，形成荧光信号；不带荧光的细胞所产生的发射光，会被普通检测器检测，形成散射光信号。


3.流式细胞仪的基本原理
这是流式细胞仪的工作原理图。细胞悬液在鞘液包裹下，逐个穿过激光器。激光器给细胞一束激光，激光被细胞散射到四面八方的角度，正对激光器的检测器是前向散射光FSC，两者在一条直线上。我们在垂直于该直线的方向上，设有分光镜，散射出来的光被90度散射光捕获，称为侧向散射光SSC。分光镜后面还会设置多个荧光检测器FL，用于检测不同波长的荧光。当单个细胞穿过激光后，会进入分选系统。电脑上设置目的细胞带电荷，带电荷的细胞会在偏转板的作用下进入不同的收集管，而不带电荷的细胞会进入废液管。


4.流式细胞分选系统的评价指标
分选速度：在做分选实验时，一般要求分选速度至少达到每秒5000个左右。
分选纯度：（已经得到的细胞）指要分选的目的细胞占分选出细胞的百分比。
分选收获率：指实际收获的分选细胞与通过测量点的分选细胞之间的比率。通常情况下，分选纯度和收获率是相互矛盾的。纯度越低，收获率越高，现在仪器设置收获率均在95%以上。
分选得率：指一群细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得目的细胞的实际得率。
5.流式细胞仪相关参数
前向散射光FSC：反应颗粒的大小


侧向散射光SSC：反应内部结构的复杂程度




取外周血，裂解红细胞，然后做流式细胞分析，结果如图所示。


荧光参数FL：反应荧光的大小。一般设备含有2-4个检测不同波长的光电倍增管，所以FL还会被分为FL1，FL2，FL3，FL4。荧光信号由激光激发标记的荧光染料、载体转染的荧光蛋白或细胞自身发出，它能反映细胞的生物学特性。




荧光补偿：荧光素的发射光谱波长比较宽泛，导致许多荧光素的发射光谱重叠，修正这种重叠就是荧光补偿。同时染两种以上的荧光时，要设置单染管来调节荧光补偿。


数据显示：主要有单参数直方图、双参数图和多维参数图。








6.流式细胞术的应用
主要涉及细胞凋亡与周期的检测、淋巴细胞及其亚群、白血病免疫分型、肿瘤耐药相关蛋白分析、自身免疫病中的应用、移植免疫中的应用。
6.1细胞凋亡的检测
细胞在凋亡早期时，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，会与Annexin V-FITC 复合物结合，发展到凋亡后期，细胞膜破裂，PI染料会进入细胞并结合DNA分子。综述，活细胞无荧光，凋亡早期细胞有一种荧光，凋亡后期有两种荧光。




6.2细胞周期的分析
利用透膜剂使PI染料进入细胞结合DNA，指示细胞周期的大致过程。


6.3临床病例分析
6.3.1取病人外周血，裂解红细胞，然后加入3种荧光染料孵育30min，再洗涤除去未结合的染料，最后流式上样。
结果图一：


结果图二：


6.3.2强制性脊柱炎
HLA-B27蛋白的表达与强制性脊柱炎的发病率有90%的相关性。选择任一细胞，检测HLA-B27蛋白的表达量。如图以T细胞为例。



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