解读文献里的那些图——Western blot

风云

Western Blot，也就是我们通常所说的“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。
那文献中出现的WB结果图应该怎么理解呢？


读图之前，我们先理解两个概念：
1.内参（Loading control）：即内部参照，WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，但是人工上样必定会有微小的误差，对于蛋白表达量少的样品，微小的差异可能会产生较大的误差，内参的存在可校正蛋白样品定量以及上样过程中的误差，保证实验结果的准确性，此外内参也可以作为空白对照，检测WB过程中蛋白转膜是否完全以及发光显色体系是否正常。通常选择在所有组织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参，常用的有β-Actin与GAPDH。内参的选择也是一门学问，选对了内参，实验也成功了一半。


2.灰度值：说白了就是看这个条带有多黑，因为跑出来的WB条带只有一种颜色，可以给我们提供的信息也只有黑色的深浅，所以这是我们分析条带的关键。条带越黑说明目的蛋白越多，但是我们不能只通过观察条带的深浅来判断实验处理对蛋白表达造成了什么影响，这种判断是存在误差的，误差来源于我们上样的时候并不能保证每个加样孔的上样量都一样，这时候就需要对western blot的结果条带的灰度值进行计算并做统计分析——目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值，以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量，这样得到的结果才更加准确、更有说服力。常用的灰度值分析软件有Image J、QuantityOne、Bandscan、Gel-ProAnalyzer、TanonImage等。
了解的这两个概念，WB结果图表达的意义一目了然，如图：


肉眼分析可得，p-Vav1蛋白的表达量对照组（control）要低于糖尿病组（diabetes），因为对照组条带较淡，右侧的柱状图——灰度值统计分析也印证了我们的初步猜想，其蛋白含量的差异具有统计学意义。Vav2、Vav3条带的对比相对来说没有那么明显，灰度值统计分析后显示无差异。
原文转载自：医学僧的科研日记（ID：zzudoctor）

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