流式细胞分选原理

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流式分选细胞原理
流式分选细胞，又可称之为荧光激活细胞分选（Fluorescence-activated cell sorting, FACS），一种利用荧光标记和流式细胞仪对细胞进行检测和分选的技术，简而言之：利用荧光素标记细胞特异蛋白分子，通过调节仪器合适的电压、补偿等，通过荧光将目的细胞与非目的细胞区分开来。使用荧光团结合抗体染色的细胞可以彼此分离，这取决于它们被染色的是哪种荧光团。例如，表达一种细胞标记物的细胞可以使用识别该标记物的FITC-偶联（FITC-conjugated）抗体进行检测，而表达不同标记物的另一种细胞类型可以使用针对该标记物的PE-偶联（PE-conjugated）抗体进行检测。



图 流式分选细胞示意图

细胞流式分选实操
2.1 准备工作
培养基准备：细胞在含DMEM/F12和100 IU/ml青霉素-链霉素的培养基中培养，培养基中添加0.5 nM地塞米松（dexamethasone）、1X ITS、0.5 ng/ml LIF、2.5%鸡胚提取物（chicken embryo extract）、50 μM β-巯基乙醇、0.5%非必需氨基酸、0.5% N2和1% B27补充剂、10 ng/ml FGF2、10 ng/ml EGF、10 ng/ml PDGFBB、10 ng/ml oncostin -m和5% FBS。细胞在34℃下在5% CO2水套加湿培养箱中培养 [10]。
小鼠准备：在小鼠和大鼠中，成体间质细胞从干细胞（stem Leydig cells，SLC）发育而来，其在出生后第7天睾丸中表达干细胞标志物血小板衍生的生长因子受体PDGFRα。到产后第 11 天，一些 SLC 致力于分化途径，形成表达 Leydig 细胞谱系标志物 3β-羟基类固醇脱氢酶 （HSD3β）、胆固醇侧链裂解（P450scc 或 CYP11A1）和黄体生成素受体的祖细胞间质细胞 （progenitor Leydig cells, PLC）。PLC分化为未成熟的间质细胞（immature Leydig cells, ILC），然后在第56天分化为成年的间质细胞（adult Leydig cells,ALC）。除青春期前动物外，在成年睾丸中也发现了SLC，这些细胞位于睾丸的管周和囊周位置并表达特异性标志物，例如PDGFRα。在此选择12周龄C57BL/6小鼠，选择小鼠间质干细胞标志产物CD51（integrin α-chain V）进行筛选间质细胞。
2.2 实验操作
实验分离间质细胞的具体步骤如下[11-12]：
（1）在无菌条件下获得小鼠睾丸；
（2）小心将睾丸白膜剥离，务必轻柔，不要把曲精小管弄破太多；
（3）37℃条件下使用2 mg/ml IV 型胶原酶（DMEM/F12配制）消化睾丸10分钟；
（4）滤器（300目）过滤细胞悬浮液并离心，并用D-Hank平衡盐溶液（D-HBSS）洗涤沉淀两次；
（5）单个细胞悬浮液悬浮在含有 0.5% BSA 的 DMEM/F12 培养基中，并在 4℃下用 CD51-PE 抗体标记45分钟；
（6）PBS-EDTA缓冲液洗涤细胞两次，并通过荧光激活的细胞分选（FACS，InfluxCell Sorter，Becton Dickinson），只需要交给工作人员即可，告诉工作人员你的荧光激发光数值。
2.3 注意事项
（1）细胞在各种操作之后的状态应该比较良好吗，因为流式操作虽然分选细胞量比较大，但是损伤也大。
（2）在重悬细胞期间可以考虑 PBS 中加入 1%-2%的胎牛血清；
（3）分流式分选仪一般没有冷却系统，要想分选后获得比较好的细胞活性，应尽量减少细胞在室温的暴露时间，在转运过程中最好有个4℃的保温盒；
（4）样本较多的时候可以考虑分批次进行，例如1ml细胞悬液，生育的按照1ml进行等分保存在4℃保温壶或者冰箱中；
（5）为保证分选效果尽可能地使细胞分散成单个细胞状态，提高分选的效率；
（6）为防止细胞粘连成块， 因此细胞密度不应过大，尽量使每个微滴中只含有一个细胞（可以问工作人员，分选一起分选微滴大小，进而调整细胞浓度）；
（7）死细胞释放的DNA 能够让细胞粘连在一起，可以尝试使用少量的DNA酶去除游离细胞外的DNA；
（8）细胞被分选出来的保存液尽可能是细胞的完全培养基（务必使用抗生素，可以使用2x抗生素）；
3 细胞鉴定
一般对于分选细胞的鉴定会涉及，异质细胞和靶细胞（间质细胞）的marker进行鉴定。对于分离来源于睾丸的的间质细胞的鉴定主要涉及两部：排出异质细胞（平滑肌细胞：Acta2；血管内皮细胞：Cd146 和 Cd31；出巨噬细胞外的免疫细胞：Cd45；生殖细胞：Ddx4；巨噬细胞：Adgre1 和 Cd115；其它促炎因子细胞：Tnfa、IL-6、IL-8 和 IL-1b；支持细胞：Sox9）；间质细胞特异marker：Cyp17a1、Scarb1、Cyp11a1 和 Lipe [11]。如此多生物，基因/蛋白，直接使用qRT-PCR鉴定即可，当然实验室有话，用WB/IF鉴定更好。

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