【Western-Blotting】WB核心理论：抗原抗体特异性反应

病理医师

在《谁发明了Western-Blotting？》中我们提到，Western-Blotting（WB）起源于核酸印迹——Southern Blotting和Northern Blotting，二者的基本原理是通过琼脂凝胶，将分子量不同的DNA和RNA分离，然后转膜及用特异性探针检测。与其类似，目前被广泛应用的WB方法也是用SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白分离，然后用特异性抗体（一抗和二抗）检测特定的蛋白。之所以能用WB检测目的蛋白，其核心理论就是特异性抗体与目的蛋白之间的抗原抗体特异性反应。本质上讲，WB所用的特异性一抗二抗和我们要检测的目的蛋白都属于蛋白质。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。在机体内，当免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟为浆细胞后所合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白（immunoglobulin，Ig），激活补体系统从而解除抗原对机体的损伤。
Ig是由两条相同的轻链（L链）和两条相同的重链（H链）通过链间二硫键连接而成的四肽链“Y”字型结构。每条L链由可变区（variable region）和恒定区（constant region）组成；每条H链也有可变区和恒定区组成，其中恒定区可分为三个结构域。从N-端起，H链的1/4肽段及L链的1/2太短在各类Ig的排列顺序可变性大，称为可变区（V区），其功能是决定不同Ig与抗原结合的特异性。Ig可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五类，IgG分子结构图见下。由于抗原、抗体在结构上具有相互识别相互嵌合的构象，抗原分子表面具有抗原决定簇（抗原表位）可与抗体分子的超变区中沟槽分子表面的抗原结合点之间在化学结构和空间结构上是互补关系，所以抗原抗体结合反应是特异性的（见图）。本段内容、IgG分子结构图及抗原-抗体的特异性反应图摘自《生物化学与分子生物学 第9版_周春燕、药立波主编2018年》。




影响抗原-抗体特异性结合的影响因素包括：
1、酸碱度：抗原抗体特异性结合的最适酸碱度pH 6.0-8.0；
2、电解质：电解质可以影响溶液pH，也可影响蛋白质的等电点；
（因此，WB的洗膜缓冲液，均用PBS/PBST或TBS/TBST等平衡盐液体，抗体稀释液和封闭液也多是上述液体配置，是为了保证抗原抗体反应的最佳条件）
3、温度：一般为15-40℃，最适为37℃；
（常用的一抗孵育时间为：室温，2-3h；二抗孵育时间：室温，1h。此外，4℃过夜封闭也应用广泛，这与抗原抗体反应的反应特点有关，涉及抗原抗体的结合率）
抗原抗体反应的主要特点有：
1、特异性：特定的抗体只能与特定的抗原（肽段/蛋白）结合，这在WB一抗二抗的种属及反应性的选择常用到；
2、比例性：抗原抗体在整个反应中存在一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应；WB中蛋白上样量和一抗二抗的稀释比例与此有关，实际操作中抗体的量相对较多，这也是为何抗体可以反复使用的原因之一；
3、可逆性：抗原抗体的结合是非共价结合，在一定条件下这种非共价结合是可逆的；因此，同一NC膜/PVDF膜在Stripping（抗体洗脱）以后可以用来检测其他蛋白；
4、阶段性：抗原抗体特异性反应分两阶段，第一阶段反应迅速，第二阶段反应缓慢，两阶段均为特异性结合；WB中抗原抗体结合在室温下，反应1小时结合率可达95%，2小时可达97%以上；4℃在，反应4-6小时可达90%，8小时可达95%（本人忘记了具体的数值，但大致如此）。

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