【原理篇】免疫荧光染色的平均荧光强度

检验之星

荧光标记是非常常用的实验方法。
一般来讲，荧光标记染色的目的有3个：①多种蛋白标记后，分析蛋白在空间上的分布特征；②免疫荧光标记后进行蛋白半定量分析，分析蛋白半定量表达量；③标记细胞核，以便分析细胞核数量，如凋亡细胞计数等。




上方所述的第1条和第3条是荧光标记染色的最佳应用场景，个人并不推荐将荧光标记应用于第2条。原因在以前就讲过→【回顾：免疫荧光分析误区，别踩雷了！】
如果一定要在荧光图像上进行蛋白半定量分析呢？其实也是有一个测量标准，即测量灰度。
<hr/>1、灰度的概念应用
与WB蛋白条带分析原理一致，免疫荧光分析也是围绕灰度进行分析。不同的荧光强度本质上可以理解成灰度值的差异，因为在分析时，我们是在同一通道下进行比较的。
举个例子，大家都是红色的，只是红色的强度和分布面积不同，这个强度可以灰度来代替。


再细化一下灰度概念，我们测量图像时，是为了得到积分灰度值或者平均灰度值。
积分灰度值即图像上目标区域所有像素点的灰度值之和，可以代表目标区域所包含蛋白的总相对表达量。
平均灰度值即目标区域积分灰度值除以目标区域面积，可以代表目标区域的平均蛋白表达量。
个人认为平均灰度值是更适合的测量指标，因为它有积分灰度值和面积这两个指标的约束，相较于积分灰度值来说更靠近客观事实。

2、通道分割
最简单的免疫荧光标记是DAPI（蓝）+单通道荧光（红或绿）。如下




这种是最普通的荧光标记，图像上只有2个通道激发光。在分析之前，必须将2个通道的荧光分割开，获得2张图像。其实这就是荧光图像merge的反向操作。
无论是image J或者是Image Pro Plus软件，都内置通道分割的功能。因此，实施起来还是很简单的。
同理，多色荧光标记其实就是多了通道而已，分割方法也是一样的。

3. 荧光强度转换为灰度
无论是JPEG格式还是TIFF格式的荧光图像，都是32bit RGB图，但是灰度图是8bit 黑白图像。
因此，在进行灰度分析之前，必须对原始彩色图像进行格式转换，最终得到8bit 黑白图像。
常做蛋白条带分析的人肯定清楚，分析之前，先对原始图像去色，然后再转换成8bit 黑白图。荧光图像的灰度分析，也是这么个道理。

4、测量
测量是很简单的。原理是在一定的分割阈值下，选择测量参数为Area、Mean gray value这两个测量指标。
值得一提的是，分割阈值。
阈值8bit 黑白图像中很重要的一个参数，它的大小直接决定了目标区域的面积和灰度值。其功能类似于彩色图像中的γ值。
有经验的朋友知道，通过调整γ值可以调整整个图像的特征；同一张图在不同的γ值下，甚至可能变成两个完全不同的图像。
所以，在进行测量时，分割阈值是非常值得仔细斟酌的测量条件。

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