肿瘤界的“扛把子” ——液体活检

Rose

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自由是个美好的东西，愿你我生活充满美好。
“生命诚可贵，爱情价更高，若为自由故，两者皆可抛”这句话我们很熟悉，但健康的身体，是追求自由的大前提，而癌症，作为健康的对立面，总让人不寒而栗。

我们害怕这种“不治之症”，但我们最害怕的是发现患癌的时候已是晚期。很多时候，如果我们能够及时发现病变，也许意味着完全不一样的结局。

今天生物君给大家介绍肿瘤界的“扛把子”—液体活检，它是肿瘤早筛和治疗的关键技术。




1什么是液体活检？

液体活检是指非入侵方式对受检者进行检查，即通过抽提外周血的方式，实时检测肿瘤动力学变化。外周血是一个汇聚原发性肿瘤和不同转移部位的细胞/DNA库，因此可以提供患者肿瘤负荷的实时情况。

液体活检专注于分析癌症患者血液中的循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA），因其对个性化医疗的明显临床意义受到了极大的关注。 对CTC和ctDNA的分析为诊断提供了新的途径，并且是迄今为止液体活检诊断的基石。

与传统的组织活检相比，液体活检具有压倒性的优势：1. 灵活的取样时间和样品保存方式；2. 避免对患者造成伤害。这为治疗/检查过程中肿瘤细胞的动态检测带来了极大的便利，同时，液体活检也是通关肿瘤早筛的金钥匙。




2. 为什么液体活检能够检测肿瘤？

在癌症患者外周血中，存在循环肿瘤细胞（circulating tumour cells, CTC）和循环肿瘤DNA（Circulating Tumour，ctDNA），它们是液体活检技术的两个“扛把子”。血液样本中CTC和ctDNA的检测可以反复进行，并且能够实时监测患者的癌症治疗。

在早期癌症的形成和生长过程中（如乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌等），一些肿瘤细胞会被释放到血液中，这些细胞就称为CTC。由于CTC存在血液中的时间比较短（半衰期为1–2.4 h），因此CTC被认为是癌症患者的实时“液体活检”。

ctDNA是指肿瘤细胞释放到外周血中的DNA，这些DNA可能来源于原发性肿瘤，CTCs或者转移过程中的肿瘤细胞，但大部分是凋亡和坏死的肿瘤细胞释放出来的DNA片段。

濒临死亡的正常细胞也会释放出游离的DNA片段，尤其是病人在手术、化疗或放疗后，这些正常的DNA会稀释来自肿瘤的DNA。因此ctDNA在所有的游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)里占极小的比列（<1.0％）。



图1.1 液体活检

图1.1 液体活检
也有研究发现，肿瘤细胞会分泌一些包含双链DNA的细胞囊泡（外泌体），但这方面的研究还存在一些争论，因此本文对外泌体不做详细介绍。




3. CTC和ctDNA有何生物学意义？

— ctDNA检测进行肿瘤早筛，CTC判断患者的预后情况。

目前癌症的检测方法（乳房X光检查，结肠镜检查，低剂量计算机断层扫描和子宫颈涂片检查）仅限于最常见的疾病，并且其临床影响十分有限。

癌症衍生的抗原可以改善癌症的筛查，常见的包括β人绒毛膜促性腺激（bHCG），ɑ甲胎蛋白（aFP），前列腺特异性抗原（PSA）等。然而，这些筛查具有较差的灵敏度和特异性。

在原发肿瘤切除后数月或数年的患者中能够检测到CTC，表明CTC数目与癌症患者预后之间具有显著相关性，意味着CTC是肿瘤转移活性的替代物或参与肿瘤转移过程。

常有一些临床没有检测到明显转移的癌症患者，在后期发现肿瘤已经转移，对这些病例进行CTC的分析，可能提供隐匿性微小残留病（MRD）分子特征的独特信息。

同时，CTC的研究能够提供蛋白质、RNA和基因组水平的治疗靶点和抗性机制的大量信息，为临床医生提供预测性和预后性生物标志物。

外周血中CTC的检测对于实体上皮肿瘤具有重要的意义（如乳腺癌，肺癌，前列腺癌和结肠癌）。很多研究人员利用CTC细胞系进行功能研究，并构建体内/体外模型来做药物敏感性的测试，但CTC培养和异体移植的效率并不高。



在不同肿瘤类型的癌症患者的血浆和血清中，存在高浓度的ctDNA片段。由于ctDNA代表疾病全部负荷的平均值，因此它可能更好地捕捉肿瘤内部和肿瘤之间的异质性。这意味着ctDNA的检测可以增强或取代其他用于癌症筛查的技术，并扩大指示筛查的癌症列表。

通过检测ctDNA监控癌症已经受到了极大的关注，同时ctDNA的检测也是对没有检测到CTCs患者的进一步检测。ctDNA的半衰期相对较短（约2h），能够作为研究肿瘤动力学的生物标记，实时评估肿瘤的变化。因此ctDNA也能够在治疗早期预测治疗反应，帮助治疗方案的实时优化。

ctDNA的另一个潜在应用是在手术或治疗后检测最小残留疾病。ctDNA是肿瘤切除后残余疾病的潜在标志，并可能决定哪些患者会复发。理想的情况下，ctDNA应在手术后但开始辅助治疗前（一般在手术后6至8周）进行测量，以最大限度地促进治疗决策。




4. CTC和ctDNA的检测和瓶颈

就像电影中神秘的黑帮老大，作为液体活检的“扛把子“，CTC和ctDNA两位大佬也充满”大牌感“。

在数百万血细胞的背景下，尤其在早期的癌症患者中，因此CTC的检测在技术上仍然十分具有挑战性，而且CTC与原发和转移性肿瘤的遗传关系目前尚不清楚。

在临床上，利用CTC的物理特性（如大小、密度或电荷），能够将其富集并分离从而进行分析。基于CTC的物理和生物特性，其富集可以在同一台设备上实现，但这种检测方法的效率仍有待提高。

利用CTCs的生物学特性，其检测可以细分为DNA水平、RNA和蛋白质水平。利用肿瘤特异性的染色体重排、基因突变、CTC扩增产物的拷贝数变化，及多重定量PCR来研究CTC中的单细胞转录组属于DNA水平的检测。

在CTC富集的细胞群体中进行全转录组扩增和qRT-PCR进行RNA水平的检测。例如，检测非小细胞肺癌中的EML4-ALK，和前列腺癌中的TMPRSS2-ERG进行肿瘤特异性易位的鉴定。

蛋白水平检测CTC可以通过使用上皮标记如EPCAM，和间质血细胞上不表达的细胞角蛋白，并在具有某些CTC蛋白特征的细胞中测试EGFR（表皮生长因子受体）扩增的水平。

目前，有关CTC生物学的重要见解以及各种创新技术已经被报道，相信联合富集、检测和CTC表征的技术平台即将出现。

在检测手段方面，ctDNA与CTC类似，能够通过深度测序进行分析。但最大的技术挑战是在具有可变量cfDNA的血液样品中鉴定出极低量的ctDNA，以及选择癌症特异性的基因组异常。



一般而言，cfDNA片段平均大小在180bp左右，ctDNA的长度比非癌症细胞释放出的DNA要短，DNA甲基化的方式也有所不同（甲基化相关知识参考），此外癌症相关的基因突变、拷贝数的变化以及微卫星的改变也能够用来区分ctDNA。

灵敏的ctDNA检测技术可以在临床表现前检测出癌症，使癌症诊断和治疗决策可以更确定地进行，患者和医生都能更及时地获取治疗反馈和预后的信息。这意味着在肿瘤早筛和预后方面，ctDNA的检测具有重大意义。

在cfDNA“海洋”中找到最小量的ctDNA，这是癌症早筛或微小残留病的检测所必需的。目前，许多团队正在为更灵敏的ctDNA检测技术“比赛”，谁能率先突破这个瓶颈，就能在肿瘤早筛方面占领高地。

Maximilian Diehn团队开发了一种新方法叫“通过深度测序进行癌症个性化分析（CAPP-Seq）。CAPP-Seq用于非小细胞肺癌（NSCLC），其设计涵盖了多种类型的体细胞改变，能够确定超过95％的肿瘤突变。

除了灵敏度以外，检测结果的特异性也是另一种挑战。因为癌症筛查研究通常需要将癌症患者与对照（健康个体或良性疾病患者）进行比较，这就要求肿瘤突变体库尽可能大，才能得出相对准确的结果。

与传统的影像学检查或标记蛋白相比，ctDNA的改变可以提前数周或数月被检测到。因此，高灵敏度和特异性的CTC分析方法十分重要！然而，与肿瘤药物的开发和批准类似，在ctDNA应用到在临床之前，需要进行大量前瞻性试验。

液体活检，是揭开肿瘤面纱的上帝之手，让我们一起期待吧！




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4.DNA甲基化——返老还童的生物学秘密
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参考文献：

• Pantel K , Speicher MR . The biology of circulating tumor cells . Oncogene . 2015 .
  
• Alix-Panabières A, Pantel K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 2016.
  
• Donaldson J, Park BH. Circulating Tumor DNA: Measurement and Clinical Utility. Annual Review of Medicine. 2018.
  
• Pantel K, Alix-Panabières C. Circulating Tumor Cells: Liquid Biopsy of Cancer. Cancer Research. 2014.
  

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