流式细胞术最全攻略：从 protocol 到问题解决

营养师

流式细胞术的基本操作流程一般包括：细胞的制备、培养封闭一荧光素偶联抗体标记、光电倍增管电压的设定、对照的设置、补偿调节，这 5 个必须环节。以流式细胞术检测细胞周期为例，看看流式细胞实验的流程和步骤都有哪些？

1、流式细胞术实验原理
流式细胞周期检测是一种常见的检测细胞增殖情况的方法之一，细胞在不同周期时，其内的 DNA 含量不同。碘化丙啶（PI）作为一种核酸嵌入型染料，能够进入固定后的细胞中，与细胞内的核酸结合，其荧光强度与DNA含量成正比。
通过流式细胞仪检测不同细胞中的荧光强度，从而判定不同组别中细胞周期发生的变化。

2、流式细胞术实验步骤
以肿瘤细胞为例：
● 将正常生长的对照或处理组肿瘤细胞计数，每组取  2×105-3×105 个细胞铺板，待细胞贴壁后，将正常培养基替换为无血清 1640 培养基，同步化 20 h，使得所有细胞都进入相同的细胞周期时期；同步完后，将培养基重新替换为正常含血清培养基，继续培养 24 h；
● 用不含 EDTA 的胰酶将细胞消化，收集细胞，300g，离心 3 min；用吸引器去除培养基，用 PBS 清洗细胞一次，再次 300 g，离心 3min；去除 PBS，用提前预冷的 70% 酒精重悬细胞沉淀，4℃ 固定过夜；
● 4℃，1000 g，离心 3-5 min，去除酒精，用 PBS 清洗 3 遍，最后一遍去除 PBS；加入 300 μL PBS，轻轻吹打，重悬细胞沉淀，加入相应量的Rnase至终浓度 100 μg/mL，37 ℃ 水浴锅中消化 30 min；
● 上机前加入 PI（5 mg/mL）至终浓度 50 μg/mL，避光孵育 15 min；孵育完后，过 300 目细胞筛，上机检测；
● 分析数据。
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