求助 我作elisa老是失败？

营养师

我第一回做elisa实验 所以问题许多  我做的是间接竞争elisa    求各位大神帮帮我啊  ！！我小白一个！！

第一是稀释的问题  稀释到底咋算？

我要稀释2w倍抗原

取1ul抗原加到1ml cb液里 配成了1ppm  然后取500ul加到9.5ml里 这就稀释成功了吧？  然后混匀包被

稀释4w 8w 16w 抗体 也是先配1ppm  然后取100ul 加到3.9mlpbs 里  混匀 取这个液体的2ml 加入2mlpbs 这就是8w  依次到16w

然后是标准品  标准品是2mg／ml  所以取  1ul加到2ml pbs里 就成了2ml  ppm  我需要配0.81ppb  就是将取2.43ul ppm定容到 3ml pbs里 然后取其中1ml 加入到2ml pbs  配成0.27ppb  这样一直配到0.01ppb

这样的稀释对吗？

第二是加样  请问怎么才能不手抖！！我觉得自己加样  真的很认真了  一个一个用手扶着加  几乎没有贴壁的液体  但是不知道为啥读完数总是有跳孔的

第三是所有步骤做完加ab液不显色是怎么回事  包括o标孔也不显色到底咋回事！！

第四ic50做完  是0.006？？  最好是0.01--0.05  还有因为跳孔曲线出不来的  这到底咋回事？

第五  如何避免跳孔  怎么做好elisa！

原文地址：https://www.zhihu.com/question/43750541

卡卡

你好！ELISA失败可能与操作细节有关，下面针对你操作问题为您解析。
1. 稀释问题：
你的稀释方法总体上是正确的，但是有些细节需要调整：
抗原稀释：
1ul抗原加到1ml CB液中配成1ppm，这一步正确。
取500ul加到9.5ml中，你实际上稀释了20倍，而不是2万倍。为了稀释2万倍，你需要取5ul加到995ul中。
建议你使用移液器进行稀释，这样可以更准确地控制体积。
抗体稀释：
先配1ppm，然后取100ul加到3.9ml PBS中，你实际上稀释了40倍，而不是4万倍。
为了稀释4万倍，你需要取2.5ul加到997.5ul PBS中。
标准品稀释：
你的标准品稀释方法基本正确，但是建议你使用移液器进行操作，避免手动移液带来的误差。
2. 加样问题：
手抖是很多新手都会遇到的问题，建议你使用移液器进行加样，并使用吸头固定器来稳定移液器，减少手抖带来的误差。
另外，加样时应保持移液器垂直，避免贴壁，并确保吸头完全插入孔内。
确保你的实验台稳固，避免震动。
3. 无法显色问题：
首先，要确保你的试剂盒质量没有问题。如果试剂盒已经过期或者保存不当，就会导致显色失败。
其次，检查你的操作步骤是否正确，比如孵育时间、温度、洗涤步骤是否严格按照说明书操作。
还要检查你的抗体和抗原是否有效，以及是否已经失效。
如果所有步骤都正确，但还是无法显色，可能是你的洗涤步骤不彻底，导致孔内残留了过量的洗涤液，影响了显色的反应。
4. IC50问题：
IC50值是反映抗原与抗体结合能力的一个重要指标，通常在0.01-0.05 ppb之间。
你的IC50值为0.006 ppb，说明你的抗体与抗原的结合能力很强。
但是，由于你出现了跳孔现象，你的曲线可能无法准确地反映真实的IC50值。
5. 如何避免跳孔：
使用移液器进行加样，并使用吸头固定器来稳定移液器，减少手抖带来的误差。
确保你的实验台稳固，避免震动。
加样时应保持移液器垂直，避免贴壁，并确保吸头完全插入孔内。
洗涤时要注意，确保每个孔都被充分洗涤，并用吸水纸吸干孔内的残留液体。
建议：
仔细阅读ELISA试剂盒的说明书，并严格按照说明书进行操作。
准备好所有需要的材料和设备，确保实验环境干净整洁。
多练习，熟能生巧。
希望以上信息对你有所帮助，祝你顺利完成ELISA实验！如果还有疑问，欢迎前来交流！

检验医师

ELISA实验是一种常用的生物化学实验技术，用于检测蛋白质、抗体、激素等生物分子。然而，在进行ELISA实验时，有时会出现不显色的情况，这可能是由于多种原因导致的。小编将和大家一起探讨ELISA实验不显色的潜在原因。


ELISA实验不显色可能是由于实验操作不当所致。在进行实验时，如果操作不严谨、步骤不准确或者试剂保存不当，都有可能导致实验结果不理想。例如，如果洗板步骤不充分或者底物溶液的pH值不合适，都会影响显色反应的进行。


实验样品的质量也可能是导致ELISA实验不显色的原因之一。如果样品质量不佳，可能会导致抗体与底物结合不充分，从而影响显色反应的进行。因此，在进行ELISA实验前，需要对样品进行严格的处理和质量控制，以确保实验结果的准确性。


实验条件的选择也可能影响ELISA实验的显色效果。例如，温度、湿度、光照等环境因素都可能对实验结果产生影响。因此，在进行实验时，需要对实验条件进行精确控制，以确保实验结果的可靠性。


综上所述，ELISA实验不显色的原因可能是多方面的，包括实验操作、样品质量和实验条件等多种因素。因此，在进行ELISA实验时，需要对实验过程进行严格控制，以确保实验结果的准确性和可靠性。同时，对于实验结果不理想的情况，需要进行仔细分析，找出问题所在，并及时进行调整和改进。

同花顺

但看步骤全部是没问题的，很有可能问题是出在没有写明的地方
之前早期的时候有一个困惑我半天的问题，后面导师盯着我做，才发现移液枪的问题，之后改正后才正常成功了，微量实验里的移液器真的很重要，而且在ELISA这种微量实验里必须要注意细节，一点小差错就会前功尽弃，这个时候不要太慌神，调节好自己情绪再从头来过最后~
有什么关于ELISA的问题欢迎评论区提问，看到都会解答~

大力水手

在板上打个格子试试。也可以做三重复

同花顺

ELISA实验讲究一个自信

• 你这个稀释步骤都挺对的，硬要抠字眼只能说稀释包被抗原的时候你没说混匀没。。但这种基本操作应该不会出问题。
  
• 手抖正常，跳孔也正常，这俩之间没关系。一般来说微孔板在孵育的时候会上摇床振荡，所以加样只要加进去体积对就行了，没必要太紧张。实验中消除跳孔最简单的方法就是多做重复，多次独立重复实验假设结果符合正态分布，然后把离群点剔了就行。
  
• 全部不显色的话结果信号值也会有问题，考虑标记抗体出了问题。ELISA的固相包被一般不会出问题，把抗体重新标记一下。
  
• 结合3来看，你确定这个IC50的信号是有效可用的？看IC50之前先看OD值梯度吧，曲线不行的话ic50的信号也没啥用。
  
• 跳孔在2里提到了一下，最简单的规避方法是多次重复实验之后剔除离群点，但是这个问题要深入研究的话就比较难了。如果你不做研发的话多说无用，除了多次重复实验之外建议多关注微孔板里的情况，比如说在摇床上如果振荡出了气泡要及时去掉。如果跳孔持续出现的话建议改良试验方案，比如洗板工艺都可以重新摸索，再进一步研究就涉及试剂的精密性优化了。