细胞实验系列1：细胞免疫荧光实验

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细胞免疫荧光相对于免疫组化实验非常简单，一般是入门实验，主要目的是用抗体检测细胞表达的蛋白。
按照实验过程大致分为两个部分：
一：细胞培养
二：细胞固定通透和染色
下面详细介绍
一: 细胞培养
    荧光显微镜对于直接用培养皿拍摄都没有什么压力，不过依然更建议做爬片，不仅效果更好而且更适合拍共聚焦，不想拍了也可以冷冻保存。爬片的预处理需要用多聚赖氨酸增加细胞粘附性
    1，用多聚赖氨酸涂在爬片上放置30-120分钟。
    2，然后用灭菌的超纯水清洗和浸泡,。
    3，自然干燥了之后放在紫外下照射至少1个小时以上。爬片之前经过高温灭菌的可以不需要这么久。
   4，如果用普通盖玻片而不是专用细胞爬片的话，一般还需要用0.1% Tween-20的PBS洗一下，因为根据我的经验，几个牌子的普通盖玻片都比较脏，不能直接用。
    5，在培养皿内滴100uL左右的培养基，然后把爬片贴上去，这样可以贴的很牢固也没有气泡。
    6，常规细胞培养，如果你的细胞贴壁能力很强，比如用胰酶都要消化3min以上的，可以不需要第一步。
二：细胞固定，通透和染色
    这几个也是免疫组化的步骤，就不用解释了。直接说流程
    1，4%多聚甲醛孵育细胞10min。或者用放在-20℃预冷的甲醇孵育5min。这两个都是常规固定液，非常规的也有甲醛，乙醇和丙酮等。
    2，用提前在4℃或者冰上预冷的PBS洗三次，不要太用力。
    3，抗原修复。不要惊讶，就是抗原修复。基本上很少有人会这么做，但是细胞免疫荧光里增加了抗原修复的步骤会让抗体更容易染上，很多做不出来的抗体都可以做出来。过程就是碱性尿素缓冲液在95℃水浴10min，自然冷却即可。
    4，透化。这个步骤取决于你的抗体针对的是不是胞内蛋白，膜蛋白不需要这个步骤。常规透化剂是0.1% Triton X-100的PBS。透化10分钟然后用PBS洗干净。
    5，封闭。封闭液可以用溶于PBS的BSA或者二抗物种的血清。BSA的浓度只要1%就可以，血清只要10%即可。如果你是用甲醛类做固定液，那么还需要22mg/ml的甘氨酸添加到封闭液里。如果你的一抗结合力很强或者二抗有非特异性结合，那么添加0.1%吐温20。
    6，用封闭液稀释一抗，4℃过夜孵育。第二天用PBST清洗三遍后避光。孵育二抗，二抗浓度大约1抗的十倍。最后染DAPI（1ug/ml）1分钟。
    7，PBS洗三遍，用抗淬灭封片剂封片。边缘处滴两滴指甲油。就可以拍照了。

一些问题，想到什么说什么：
1，荧光并没有那么容易淬灭，即使操作的时候没有避光，自然光下也达不到让你淬灭的影响实验观察的效果，真正容易淬灭的是观察的时候，比如一个视野长时间用短波长的光源照射。
2，非特异性染色是免疫荧光最大的障碍，来源于两个原因，第一是固定液残留，这里需要缩短固定时间并且在封闭液中加甘氨酸，并且抗原修复也可以帮助解决非特异性染色。第二个原因就是二抗残留，二抗需要用带有吐温20的PBS溶解，只要荧光显微镜的强度还可以增大，那么就可以增加吐温洗脱掉非特异性染色。

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