CRISPR 到底是一种怎样的技术？

千姿百态

本问题已收录进专题：世界首例基因编辑婴儿在中国诞生，这可能不是个好消息
补充，今年获奖了：豪华版诺奖：2015生命科学突破奖颁布，CRISPR研究者获奖
CRISPR 全称该怎么理解？到底是怎么使用的？谁能用通俗的方法给非生物学科的人解释一下？
然后就是这项技术究竟有多大意义？是不是真的是很重要的突破，在未来某时大家治病可以直接修改基因了？
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原文地址：https://www.zhihu.com/question/22356523

长长的路

CRISPR技术虽然是现阶段生物界非常新而且非常热门的一门技术, 在各大门户网站上有很多文章已经对于此项技术进行了详细的介绍. 但是本篇文章本着简洁, 通俗易懂的理念, 将细致的介绍CRISPR的相关概念并且阐述作者自身对于CRISPR这门技术的理解. 适合刚刚接触CRISPR系统的人进行学习探讨.
在本文中, 我将介绍什么是CRISPR 系统, 其结构特点和作用机制. 同时也会概括性的介绍CRISPR 在现阶段的应用, 和gene drive(基因驱动) 技术.

(1) CRISPR/Cas: 强大的基因组编辑工具
精准, 简便的对于基因或者基因组的信息进行编辑对于生物学家了解生物体内的代谢过程, 生物体内基因的功能研究和现代基因治疗都有着至关重要的作用. 之前的基因组编辑技术, 例如锌指蛋白 (Zinc Finger, ZFNs)和转录激活因子样效应物
(Transcription activator-like effector, TALENs) 对于基因组编辑的发展做出了不可磨灭的贡献. 在这两种技术当中, 基因编辑的工具在基因组上的定位依靠蛋白质与DNA之间的相互反应, 而对于基因组的剪切过程依靠Fokl蛋白. 图一中, 彩色的圆形或椭圆形代表了合成的锚定蛋白 (Fig.1). 但是锚定过程依靠DNA 与蛋白质相互作用的一个显著的缺点就是当要锚定新的基因位置时,需要对于锚定蛋白进行重新设计和合成, 这大大的加大了基因编辑的工作量和难度, 使这些技术较难适应高通量的基因组编辑工程.




Figure 1: Zinc Finger, ZFNs and Transcription activator-like effector, TALENs) technologies.

CRISPR/Cas系统作为一个革新性的强大基因组编辑工具的出现改变了这一境况, 可以说是颠覆了基因组编辑这个领域. CRISPR的全名是 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), 中文意思是成簇的, 规律间隔的,短回文重复序列. Cas 所指的是
(CRISPR-associated). 与上述的工具之间的不同之处是, CRISPR/Cas系统对于基因组上基因的定位利用RNA 与DNA 之间的相互作用, 对于新基因位置的锚定只需要一小段新的RNA序列, 这个特点大大的减少了新和成蛋白的工作量, 且特异性是很高的. 具体的机制在下文会有介绍. CRISPR/Cas系统之所以成为基因组编辑界的新宠是因为这个工具具有很多其他工具不具备的优点, 例如, 合成简便, 使用方便, 低费用,特异性高等.
(2) CRISPR/Cas系统的结构
CRISPR/Cas系统是细菌体内的获得性免疫系统, 是用来对抗侵略细菌的外源DNA, 质粒和噬菌体的. 与普通的原核生物的general的免疫系统不一样, CRISPR/Cas系统是获得性免疫系统, 这就意味着这个免疫系统是具备“记忆性”的. 他可以记住入侵过的外源DNA 和噬菌体, 并在他们再次入侵的时候切断他们基因组, 被切断的基因组将变为线性,无法进行复制和表达,并被细菌体内的酶降解掉. 这个免疫系统虽说简单, 但是却非常实用且强大.
CRISPR 系统是一个什么样的结构呢. 简而言之, CRISPR/Cas系统由两大部分组成: 第一个部分是编码Cas相关蛋白质的基因(在Fig.2中的白色方块箭头), 这些Cas蛋白在获得外源基因片段和剪切外源基因上都起着重要的作用. 第二大部分被称为CRISPR array, 这个部分中包含了repeat序列和spacer序列, 这两种不同的序列是间隔开来的, 本着两个repeat序列夹一个spacer序列, 正如Fig.2所示, 黑色菱形代表repeat序列, 不同颜色的方形则代表了不同的spacer序列. Repeat序列在同一细菌中的碱基组成和长度是相对保守的, 基本不变. 在不同的细菌之间会有些许差异. Spacer序列则是用来锚定目的外源基因的, 所以spacer的序列碱基组成差异较大, 因为他们来自于不同的外源基因. Spacer 基因当中包含着被锚定基因组中的特异性高的保守序列, 确保在之后转录出的RNA 可以与被锚定基因组精确配对. CRISPR array之前通常会有一个富含A-T的leader sequence, 这个序列中包含启动子, 是用来启动repeat 和spacer序列转录的. CRISPR array 不包含阅读框(ORF, open reading frame).




Figure 2. General CRISPR/Cas system locus.

(3) CRISPR/Cas 系统的作用机制
CRISPR/Cas的作用机制可以分为两个主要的部分: Adaptation和Interference. 第一个大部分Adaptation根据我的理解可以又分为两个小部分, 分别是Spacer序列的获取和CRISPR RNA
(CrRNA)的合成加工. 下面对于作用机制的解释基于Fig.3.
1. Adaptation: Spacer的获得
当噬菌体或者外源基因侵入到细菌体内后, 其基因组中的protospacer会被CRISPR/Cas系统中的cas相关基因进行识别而剪切. Cas蛋白对于spacer的识别获取基于其序列下游的PAM (Protospacer adjacent motif) 序列, PAM 序列在spacer获取和CRISPR系统的体外设计中都起着至关重要的作用. 不同的CRISPR/Cas系统的PAM识别序列也是不同的. 当Cas相关的蛋白选择spacer后, 会把其基因剪切下来, 并插入到leader序列和相邻的repeat的中间, 形成新的spacer. 这样, 下次同样的外源基因入侵时, 就可以对其基因组进行剪切了. Spacer的前面是需要有repeat的, 这和后面形成城成熟的CRISPR RNA 很重要. 为了不影响读者对于机制一个大概的理解, 新插入的spacer前是如何形成新的repeat序列的, 作者将在Appendix1中作介绍.



Figure 3. Adaptation process, including spacers acquisition and crRNA biogenesis.

2. Adaptation: CRISPR RNA (CrRNA) 的形成
之前提到过, leader sequence中具有启动子, 可以启动后面CRISPR array的转录, 这个转录是连续的. 因此转录出的RNA 产物是一条长链, 其中包含了CRISPR array中所有的spacers和repeats, 这条长链RNA 被称为precursor transcript (pre-crRNA). 如Fig.4所示, 长链pre-crRNA会随之被细菌体内的管家基因表达的酶或者Cas相关的蛋白(取决于CRISPR系统的差异)所加工剪切, 使之称为成熟的, 含单一spacer的crRNA. 转录出来的spacer RNA 序列是和目的锚定基因互补的, crRNA 可以引导Cas相关的蛋白去剪切目的基因组中的基因.




Figure 4. crRNA biogenesis

3. Stage II: interference
在成熟的单一spacer的crRNA形成之后, 其会与Cas相关蛋白和其他的RNA 组分组成一个复合物, crRNA 可以与外源基因中的基因互补配对, 并引导Cas蛋白或蛋白复合物对外源基因片段进行剪切. 正如fig.5和fig.6所示. crRNA和Cas相关蛋白质组成的复合物是根据不同种类 CRISPR系统而不一样的. 在最常用的type II系统中, crRNA会与noncoding trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)互补配对再与Cas9蛋白形成复合物进行DNA 剪切. 这个在后面会介绍.



Figure 5. Stage II interference.



Figure 6. schematic of interference stage.

(4) 不同的CRISPR 系统
CRISPR/Cas系统大体可以被分为两类, Class 1 (包含了type I, III, and IV), 和Class 2(包含了type II 和type V和type VI). 在Class1 中, 对于外源基因组的剪切需要一个大的Cas蛋白复合物(由不止一种Cas蛋白组成)和引导RNA. 在Class2中, 对于外源基因的剪切只需要一个单一的剪切蛋白, 例如 TypeII中的Cas9蛋白和TypeV中的cpf1蛋白. Fig.7中清晰的表明了在何种阶段, 有何种Cas相关的蛋白参与.
在人工合成Cas系统时, 最常用的是Class2 CRISPR 系统, 因为对于DNA 的剪切只需要单一的Cas9 蛋白或者cpf1 蛋白, 非常简单便捷.



Figure 7. functional classifications of Cas proteins.




Figure 8. Genomic architectures of the known and newly identified Class 2 CRISPR-Cas systems.
Fig.8 示意了type II 中的三个subtype和Type V中CRISPR 系统的基因结构. 各中Cas蛋白的作用可以对照Fig.7去看. 其中的tracrRNA在上一节中有所介绍. 在对DNA 进行剪切的时候tracrRNA 会和CrRNA配对, 形成guided RNA引导Cas9去剪切DNA. 其中详细的结构示意图在Appendix2中显示.

(5) Type II CRISPR 系统体外的合成策略和应用原理
第三章节中介绍的CRISPR作用机制是细菌体内的作用机制, 是应用CRISPR技术的基础. CRISPR 之所以被称为是一个强大的基因组编辑工作是因为他操作简单, 合成也非常的便捷. 上面提到了TypeII CRISPR 系统是最常用的系统. 那么在这一节中我就以type系统为例介绍CRISPR的应用.
首先我们先看Fig.9, 这是一个非常清晰的示意图. 在实践应用中, 我们会先选择需要进行锚定剪切的基因, 基因的选择要基于PAM 序列, 之前介绍过. 那么type II 的PAM 序列就是NGG. 也就是说, 在目的剪切的基因上, 与剪切的基因片段后必须要有一段PAM序列, 这对后面Cas9的识别和剪切是必要的. 再选择好欲剪切的基因片段后, crRNA则是被选择的这一片段. 随后tracrRNA是必须的, 因为其要和crRNA形成特殊结构后才可以引导Cas9蛋白去剪切. 由Appendix2可以看出, tracrRNA与crRNA配对的部分是repeat基因, 所以在实际应用中, 一个tracrRNA就可以和不同的crRNA (包含目的基因的protospacer和repeat序列)相配对了. 而sgRNA (single-guided RNA) 是体外人工合成的, 可以引导Cas9区剪切目的基因.
Ps: 在实际操作用, 可以不需要linker loop. (如Appendix 2 所示), 因为如果使用linker loop, 对于有每一个spacer都要转录一次tracrRNA. 如果一个系统中有多个spacers, 则按照Fig.8 的基因结构合成即可.



Figure 9: Schematic of artificial type II CRISPR systems
那么当把基因剪断了之后, 该怎么办呢? Cas9蛋白可以引发DNA 的双键断裂, Cas9中包含了HNH , RuvC-like 和PAM序列交流活性区. HNH 和RuvC会各切DNA 的一条链, 造成双键断裂. 正如Fig.10所示. 如果对HNH和RuvC活性区域进行突变使之无法行驶剪切的功能的话就会产生Dead Cas9 (dCas9). dCas9 只可以提议性的附着到特定的基因位置上 (依据sgRNA 上的序列), 而不可以行驶剪切功能. dCas9在CRISPR的各类应用中起着很重要的作用.还有一种方法就是只对HNH或RuvC的其中一个位点进行沉默突变, 形成和Cas9 nickase, 这样就可以用两个不同的nickase对基因组进行锚定和单链剪切, 造成粘性末端.



Figure 10. Schematic of main domains of Cas9 protein.
如Fig.10 所示, 单一的CRISPR系统可以造成平末端的DSB (double
stranded break), 两个Cas9 nickase 系统可以造成粘性末端的断裂. 当DNA 的双链被剪切了之后, 有两种修复方式: 第一种就是NHEJ, 不同源的末端修复. 这是生物体内自发的SOS修复, 紧急连接断裂的DNA 双链, 但这种连接方法是随机的, 油价可能造成碱基的插入, 删除, 造成阅读框的移码. 而另一种是HDR, 同源定向修复, 提供一个两端序列和断裂序列相同的donor DNA小片段, 这个DNA小片段可以与断裂的基因进行同源重组, 由此形成目的性的插入基因, 删除基因等功能 (红色标出的片段是目的插入片段). 由此可以完成基因组中基因的定向改变, 插入和删除.
Fig.10中的第三个图则是运用了dCas9 (dead Cas9). 并在Cas9蛋白上附着上FokI 酶, 这样两个dead cas9 就可以实现基因的定位而不可能剪切, 而FokI 酶行驶剪切效用. 这样的双锚定功能会大大较低CRISPR 系统的脱靶效应 (off-target).



Figure 11. Cas9 in genomic editing.
(6) CRISPR系统的不同应用
CRISPR系统最先的用途就是造成DNA 的双键断裂, 在使用NHEJ 或者HDR的方式进行定性,目的基因的编辑. 但很快, CRISPR系统就应用到了众多领域. 例如激活或抑制转录反应. 下面以Fig.12 为例做介绍. 图A呈现了正常的Cas9蛋白和dCas9蛋白. 图B的第一幅图将 w subunit与dCas9 蛋白融合, 这样Cas9蛋白可以定位到特定的位置, w subunit可以召集转录因子, 由此激发转录过程, 第二幅图, dcas9可以结合到RNA聚合酶的下游, 阻挡聚合酶继续转录从而抑制转录. 图C中则同通过融合VP64去激活哺乳动物细胞的基因转录和通过融合KRAB去抑制转录. 而图D则更为先进, 相比于图C中只融合一个VP64激活因子来说, 这里的方法是融合一个多肽(scFV peptide), 其中包含了VP64, 而多肽之间是可以结合的, 这样就大大的提升了激活因子VP64的召集率, 一个dCas9蛋白最多可以召集24个VP64, 大大提升转录效率. CRISPR系统在转录的激活与抑制上还有很多应用, 这里不详细介绍, 有兴趣的读者可以去自行阅读下方的参考文献学习.



Figure 12. Engineered CRISPR interference systems and different applications.

除了转录的激活和抑制之外, 还可以把荧光蛋白融合到dcas9上, 这样可以通过guide RNA 的引导去定性结合特殊的基因位点, 从而便于观察. 这对于观察一个目的基因的表达强度和表达历程是非常有用的. (Fig.13)




Figure 13. Overview of CRISPR imaging. Sequence-specific enrichment of fluorescence signals by sgRNA-directed dCas9-EGFP allows the imaging of genomic elements in living cells.

大力水手

之前同学发我的一份儿有关这个东东的文章，贴上来：
在表观遗传学、干细胞、癌症研究如火如荼的今天，大家似乎都把目光投入了更加“高等”的生物。然而原核CRISPR系统的发现和应用却再次证明了“低等”生物的存在感——谁说这些“小东西”不能有精妙复杂的体系？
    CRISPR系统不但丰富了我们对于细菌、古细菌生理机制的认知，更重要的是这种体系的改造利用能带来席卷整个分子生物学领域，更新现有操作模式的一场技术革命。同时，它也为我们打开了一扇窗，从CRISPR的角度重新认识整个微生物世界自我和相互间的调控网络、调控机制，原核及真核细胞间的异同和联系，甚至协同进化的证据。
没人能否认，这次，“小东西”的确搞出了“大名堂”。
一、初露锋芒，刮目相看
——细菌也有“高级”的获得性免疫系统
    到底什么是CRISPR？ ——它的中文名很长很拗口，和英文一样不知道怎么念，却能顾名思义，了解其基因序列上的特点，那就是——成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。 既然是讲故事就把关子卖到最后，讲到那里再告诉大家这些定语的含义。
是个啥？
  任何伟大事物的开端（原谅我下此断言，不过看溢美之词甚盛【21】【22】，也不算过分），任何风云人物的发家，任何跌宕故事的开始，总是不起眼“其貌不扬”的，我们的主角CRISPR系统也不例外。
  很多综述【3】里都把CRISPR的起源说在了1987年，还是从我们最熟悉的E.coli,最经典的K-12株系中发现的，但是本着挖祖坟的心态费劲找出这篇26年前的文章【7】来考据，却发现似乎其中只有这一点是与我们的CRISPR沾边的，就是这个回文序列。


“叫”个啥？

    这个发现纯属偶然，也没有引起包括发现者本身太大的重视，甚至这种特征序列都没有一个名字，直到2002年，在通过计算机操作发现很多原核生物（真细菌和古细菌），都有类似被21-37bp的回文重复序列间隔开的非重复序列后，他才正式有了这个顾名思义的名字CRISPR，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）【8】。并且除了这样的特征序列外，在他们的附近还有一写CRISPR-associated基因。也就是我们后来说的发挥大刀剪切作用和整合外源片段作用的一系列Cas蛋白。于是我们基本可以得到这样一张漂亮的模式图，并清楚了CRISPR系统中最重要的3大元件—spacer（白色方块），回文repeats（双三角），cas等基因。



“干“个啥？

   一开始，由于spacer序列种内保守，种间差异的特点，一度甚至现在【30】也在被用来鉴定菌株，回头看来虽然大材小用，但好歹也是广泛应用性的体现。
   还是和大多数科学发现一样，CRISPR系统的发现经历了一个搞清：是个啥？——“叫”个啥？—— “干”个啥的过程。
  现在我们已经知道他长得什么样子什么特点，可是关于这一奇怪序列是干什么的，在很长一段时间里众说纷纭。
功能显然和spacer的序列特异性有关，那么是chromosomalrearrangement？ modulation ofexpression of neighboring genes,target for DNA binding proteins,？replicon partitioning,还是DNArepair？
   都有道理不过只是猜测，直到2005年，3个课题组独立的数据分析表明——这些spacer是外源DNA来源的，病毒或者质粒。【3】于是才让大家想，外源DNA，这会不会参与了防御外来DNA呢？
   2007年Streptococcusthermophilus的实验证实了这一猜想，于是经过不断完善，有了我们下面这张华丽丽的示意图，一个只能用elegant形容的漂亮的免疫过程。
漂亮的获得性免疫系统——谁说这是“高等”生物的专长？
   如何解说这个漂亮的系统，我想参照我们学过的抗原抗体免疫很容易理解，这里用一个通俗的比喻（如下图3）简单讲讲。
  外源DNA就是坏蛋，而抓住坏蛋特征这一最核心的步骤之一则是——靠的Cas复合体将片段特征proto-spacer制作成spacer，整合进CRISPR序列中，形成记忆。于是接下来的2次免疫中，spacer便可以快速bingding到proto-spacer上。完成这一target的精确打击过程。干掉入侵者。
  估计大家也都注意到了一个特别的“帽子“ PAM（下文中也会提到）这里作为一个防止自身免疫的机理出现，不难想到当然也同时也制约了proto-spacer的选择。




图4原核生物CRISPR获得性系统工作原理图【3】
     怎么样？是不是有够震撼？不夸张的说，这个流程图真的很冲击我的旧思想，谁也别“小”看原核生物啊！这么精妙的，不亚于真核的获得性免疫，不得不：1、让我们惊叹于这个奇妙的世界——造物主和原核小东西们的聪明才智。2、扪心自问——对于自然和生物，我们真的还知道的太少了。
   当然，CRISPR也不是原核生物唯一的防御系统，近期的一篇NAR【15】也横向总结比较了真细菌与古细菌的各种免疫机制。但是毫无疑问的是，CRISPR的发现极大的扩充了我们对于原核生物生理机制的认知。
  跟据最新的官方说法【31】目前，已经在48%的真细菌和95%的古细菌中发现了CRISPR系统。可以算得上是普遍存在了。2007年就有法国的课题组开发了一个CRISPRFinder【12】，让大家上传序列，来鉴定该基因组中是否包含CRISPR。从而统计CRISPR的在原核生物中存在的普遍性。（这里的统计数据和刚才说的有出入，尚未能证实其关系）



图5 网络工具CRISPRFinder（2013年6月5日截图）



图6 各种Type的CRISPR【16】
      CRISPR系统也是有很多Type的，不同细菌中含有的CRISPR的type也不一样。上图是2013年的一篇非常棒的review当中对几种type作用机制的整理。（是不是几年之后绝对入主教科书呢？不入也没道理啊。）在这里，也要提醒大家特别注意type-II，因为后面的故事，Cas9将会扮演绝对主角。
似曾相识，本是同根生？
    看了上面的流程图，我想大家都会觉得“面熟”，没错，看了下面的一张比较图，更会觉得原核真核之间机制的相通性。也许，我们的差距没有想象中那么大。



图7和真核RNAi比较Parallels and distinctions between CRISPR RNA-guided silencing systems andRNAi.【11】
二、 深入了解，为“我”所用，指哪打哪
——Cas9等机理研究和工具改造
    故事如果就到这里，那虽然有趣，充其量也只算是认识自然。其实，真正的好戏才刚刚开始。
   随着CRISPR重要性的逐渐显现，对它的作用机理研究也一步步深入。【10】【14】【16】各个方面，各种类型的蛋白作用渐渐清楚。比如如何将spacer整合如基因组？【14】中，Csn2作用的模型建立。



图8 Csn2参与整合spacer模型
移花接木，给细菌打“疫苗”！
    于是就有人在想，既然这看起来是个不错的免疫体系，既然大肠杆菌中这个体系看似不够强悍，能不能移植啊？
    答案是肯定的。2011年，NAR杂志上，法国的一个课题组【4】正是做了这样的一件事情——将Streptococcusthermophilus嗜热链球菌中的Type-II CRISPR系统利用质粒系统移植到了大肠杆菌当中，发挥了作用！于是他们很愉悦的得出了结论——CRISPR是可以用来给细菌打疫苗的，我们了解他的天敌，就可以主动防御，先发制人。
   同时，几乎是“顺带”，他们还发现了2件事情，
   1、Cas9“一粒起效”——作为唯一需要的，足以起作用的剪切蛋白（强悍性充分性）。
    2、Cas9“左膀右臂“ ——起作用依赖McrA/HNH- 和RuvC/RNaseH这两个motif. 。从此Cas9也从那么多Type【16】的CRISPR的蛋白中，款款走入了我们的视线。



图9 利用质粒实现Cas9-嗜热链球菌CRISPR系统往大肠杆菌的移植
     所以说第一次，他们证明了CRISPR不但可以免疫自己，还可以异源表达，免疫他人，这就是“疫苗”啊，很有意思。
    然而从故事的后续发展来看（如果我梳理的逻辑中没有落掉太多东西），他们实在浪费了一块宝藏，大材小用了。而这篇文章结果的重要性也被研究者本身严重低估了。不能说他们愉悦的结论和细菌的疫苗不重要，只能说他们只看透了一层，没有看到更深的一层，没有看得更远。
    为什么这么说，因为虽然他们没看到，但是有人看到了。并且真正成功的奥秘就在于那两件顺带的发现。
“一粒起效”，果断改造——从此剑锋直指！
    如果要在CRISPR系统的研究中树一块里程碑，我想【2】他是。如果要在这个故事里有个转折，我想他【2】也是。从这里开始，CRISPR的传奇将开始上演，新一代分子生物学革命的帷幕即将拉开！
  2012年8月17，一篇看似低调的Science，看那些胶图和data也没什么意思，这里用我的语言简单总结一下他们主要做了些什么：
    是的，流水账一样，到这里这文章看起来没啥难度，也没啥亮点。但是，细心地你发现了吗，到这里，他们已经一步一步的把Cas9作为定向内切酶的每一步机制，方方面面都搞清楚了。
  插一句，又有一个被忽略（至少在这篇文章里没大动作）的意外惊喜——2个“左膀右臂“domain是各切一条链，HNH domain 切 complementary DNAstrand， RuvC-like domain 切 noncomplementary DNA strand 。
  接着说，他们把方方面面都搞清楚了，但这仅仅是一个机理研究吗？错！他们有非常明确地目的——剑锋直指！可以人为定制的特异性内切酶！为我所用，指哪打哪。
他们紧接着就利用这些发现，设计，做了体外切割GFP基因的实验，果然获得成功。并且都是按照预想的设计的切口切开，这难道不是“想切哪里切哪里，妈妈再也不用担心我的课题”？。
同时，推断由于限制性的PAM的序列NGG很常见，基本上利用的限制很少——有望可以实现见人杀人，见鬼杀鬼！并且2个必须的RNA已经可以“双剑合璧”，这样可以使构建的RNA更方便也更稳定。一个新型“大杀器“呼之欲出。



图10  crRNA 和tra crRNA的“双剑合璧”【2】
  （对了，这里要特别提到的是【13】，和【2】内容非常相似，同年9月4号的PNAS，如果没什么意外，应该是晚了一步。看来做科研，不但找准方向，下手稳准狠，动作还要快啊！）
   好了，现在已经是“司马昭之心，路人皆知”了，再笨我们也猜到他们的目的了——构建一个可以按需定制的DNA定点剪切工具。然而又一次，我们要说，技术和发现放在那，决定高度的是你能看多远。（也有可能他们想到了但还没做到）
   “万事俱备，只欠东风”。基础已打好，序幕已拉开，热场已完成，真正的好戏就要开演了。
三、 “洲”际导弹，秒杀众生
——多种真核、原核细胞中的基因编辑、合成生物学利器
    刚才的序幕估计只是让关注该领域的人激动兴奋了一下（而且好多人也正是从关注这篇文章开始进入领域，开始抢滩），然而真正让CRISPR系统走进所有人的视野，发出不容忽视的声音，引发了震动的是接下来的两篇文章。虽然我们这个故事从头讲下来你觉得仿佛有此文章顺理成章，但是乍一看，两篇文章的成果实在太诱人，太漂亮了。也的确，短短5个月，向前迈进了一大步，重要的一大步。
    虽然说是2篇文章，意义却是一个，他俩很有意思，背靠背，连着印在同期的Science上，一前一后。第1篇【1】就是丛乐学长的文章了，而第2篇【17】来头也不小，是George M. Church课题组的作品。
   （应该说，可以看出第二篇文章几乎是被第一篇的文章“逼”出来的，有种赶着发没有well-organized的感觉，但其实做了很多东西，具体后面再说。其实还有杯具的同样的第3篇【18】，来晚一步，只好nature子刊了。）
    这2篇文章的突破就是——在人类细胞中，成功实现了由Cas9介导的基因组定向编辑。
  （注意是编辑，而非简单地剪切。嗯，GenomeEditing，是不是听起来就高端大气上档次。）
“洲”际导弹，深入敌镜，精确制导，圆满完成



图11   组装导弹，直入腹地---入核导弹系统【1】
  先来看看第1篇，第2篇的异同稍后再表。想在真核内实现基因组的编辑，第一步就是要进核。NLS就是潜入目标的伪装，戴了 2个帽子，一头直入腹地。当然导弹必备的爆破装置Cas9和定位装置crRNA等也必在导弹组成中。
调试导弹，精简装备
  顺利完成第一波实验，继续调试导弹，居然有惊喜——装备是可以精简的，RNaseIII不是必须的，因为估计“不明真相的群众”也就是人类细胞内的同样蛋白是可以帮忙的！
  同时也发现“制导”位置不同，在一个loci中target的序列不同，效率也不同。他们也尝试了双剑合璧，但是发现组合制导效率略低。



图12 变“战后重建”为“和平殖民”，减少毒性———用HR插入新东西【1】
   这是很赞的一步，这里就充分利用了我们说的一个domain切一条链的发现，变双链切断为切开单链的一个口，再导入外源片段，从而介导HR，通过重组的方式实现片段替换——从而插入，删除，等等，都成为了可能。



图13  “万箭齐发”同时一块儿切【1】
    另一幅让人激动不已的途径就是可以万箭齐发，而这也充分利用了CRISPR系统本身的特性——人家本来就是个array嘛。
当然，还有比较容易想到的就是下面这种删除方式：



图14 切两头，直接删除一段【1】
总之一句话——导弹在你手，想怎么玩，就怎么玩！
      讲完了丛乐的文章，下面就说说第2篇文章与丛乐文章的不同之处——



1、用且只用“双剑合璧装”guide RNA(gRNA)  图15【17】



2、鉴定体系用的是  GFP rescue，更漂亮图16【17】
3、做且只做 human cells 更多关注在人细胞中（包括iPScell）的实际应用。
4、做了庞大规模的生信设计，目标针对整个基因组水平设计全几组靶标，覆盖近一半基因。（野心很大啊，名家风范）
5、与ZFNs ，TALEN 比较的实验更多。
6、工作量更大，数据量更大。
     所以看来，动手快是多么重要，差点到手的鸭子被别人抢了总是不好的，然追求完美也是有价值的。
此剑一出，谁与争锋
   最后简单总结一下，这目前为止，故事的高潮部分是这个样子——
1、实现真核细胞体内的基因组编辑，而且一下子打通关了，直接搞定了终极目标——“大boss”human cells
2、利用单链切除介导HR（同源重组），变单纯的切为定向编辑：想插入，改写，删除，全部满足你
3、实现“万箭齐发” ，别再打一枪装一次子弹了，咱已然进入机关枪时代了。
4、证实了与TALEN比的优越性（大家都懂得，其实即使在效率差不多的情况下，无需新编码蛋白而是换短序列即可的Cas9，比TALEN有着不可逆转的便捷性优势）
总之，我们获得了一种想打哪里只需要换“定位弹芯”-gRNA  就行的基因导弹，定点、准确、体内体外、原核真核都可以。更重要的是方便、便宜（“几个质粒就OK”）。
     如此利器，预示前景一片大好，自然各家不吝溢美之词【20】【21】【22】【23】【29】。
有人欢喜有人忧，你方唱罢我登场——更高、更快、更强
      如果说Cas9开启了一个基因分子生物学的新时代，大家都开心还来不及，只有一个人哭的话，那就一定是TALEN相关公司了。
       正所谓“长江后浪推前浪，前浪死在沙滩上”，科学也有更新换代，算是自然规律使然。Cas9无论是从理论分析，可行性便捷性，还是实际结果，效率上都轻松的“秒杀”了前任明星——TALEN。【1】【17】【19】【21】.
      没办法，在秉承了“更高、更快、更强”精神的Cas9同学面前，曾经风光无限的TALEN同学只能默默垂泪离去，剩下一堆公司做好准备血本无归了。
百花齐放，四海皆准
    Human这个大boss都搞掂了，剩下的估计问题不大。也的确是这样，一时间，各种物种体内的Cas9运用文章哗啦啦的冒出来——斑马鱼【24】酵母【25】小鼠（多基因同时，还是丛乐老板课题组的作品）【26】细菌（仍然是丛乐老板课题组作品）【27】，Cas9大热正式出现。
      眼看，一个Cas9的时代就这样到来了。
精确定位，潜力无穷
    其实，Cas9的成功给了我们一个运用CRISPR系统方便快捷定位基因序列的可能，但仅仅局限于编辑基因吗？其实可以做的远不止于此。



图17 利用Cas9定位控制转录【28】
    比如可以利用这种特异性，做有针对性的表达调控【28】，比如利用双切致死性“自动”筛选突变株【27】。未来，也许还有更多应用，开动脑筋改造他，还有很大潜力。
四、惊喜连连，奇妙继续
——CRISPR系统在各个层次的广泛性与给我们的认知拓展
     主观来讲，一个好故事的结尾总是留有悬念的开放式，为了讲个好故事，我们的CRISPR也不负重望，更多发现，让我再多写一节。
     客观来讲，能够开启一个分子生物学的新局面已经够牛气了，可是偏偏人家还有更大的使命——让我们继续思考原核的种种，调控网络的种种。
道高一尺魔高一丈——病毒抗CRISPR系统机制
     有个问题不知道大家有没有想过，如果CRISPR在原核生物中真的那么所向披靡，那噬菌体、病毒对于细菌早就没任何威胁能力了，早就给干掉了。“这不科学啊”~
    俗话说“道高一尺魔高一丈”，你细菌能有CRISPR对付我病毒，我病毒也必然有一套甚至几套机理来对付你。【6】【31】
    “别拿豆包不当干粮”，别拿病毒不当生命，人家不但能“借尸还魂”繁殖自己，连特异性的免疫系统，都是可以有的！
奥特曼与小怪兽共同成长———军备竞赛，协同进化
     正如这个有趣的题目CRISPR-mediated phageresistance and the ghost of coevolution past【33】，让我们感兴趣的是CRISPR系统中那些细菌病毒协同进化的证据。【31】中噬菌体对抗CRISPR基因来源等表明，细菌和噬菌体简直“你中有我”“我中有你”，不断竞争，共同成长。
     想一想，大自然的法则多么有哲学意义啊！
苦肉计——自身抗逆，作用比我们想的更多
   更玄妙的机制是这个“苦肉计”——细菌通过CRISPR调节自身基因，帮助自己躲避哺乳动物的免疫系统。
   2013年4月的一篇文章【5】表明细菌Francisella novicida的传染力依赖自身的CRISPR系统。 在哺乳动物细胞内生长时，细菌会通过CRISPR系统关闭自身脂蛋白的合成基因，以避免被宿主免疫系统发现并摧毁。
“如果将宿主的免疫细胞比作大海中的鲨鱼，那么对于它们来说，细菌脂蛋白就如同海水里的血一般充满着吸引力。因此，为了不被免疫系统发现，细菌就必须关闭脂蛋白的生产。”
    太神奇了！
  “除了切割噬菌体基因以外，Cas9还能够调节细菌基因，这是一项新发现，”
  看来CRISPR系统是一种原核生物间、原核和真核之间综合性的调控网络的中心，是原核生物抵御外界不良环境的手段方法，并非切切外源基因那么简单。也给了我们一个机会，让我们从CRISPR的角度重新认识一下奇妙的“微生物界”。
    当然，还有更多关于CRISPR的报道【32】引导我们继续去关注。
“小东西”搞出“大名堂”故事的“启示”
       好啦，故事讲到这里也差不多了，是时候总结一下啦，故事梗概如图所示，多说一遍也没啥意思。
     “不幸的各有各的不幸，幸运的都差不多一个样子。”其实想想，也许这就是一个nice的科学故事该有的pattern——从最初一片草莽中被慧眼识英雄，到研究不断深化，打开一片认知新天地，甚至改写固有“教科书”，改变固有观念。而后派上用场，为更多研究服务。并且同时开启一个新领域，新视野。
     然而这个故事的意义还在于提醒我们怎么做好的研究，回顾整个故事，其实无论在哪里及时进入有所建树都是很好的研究。关键在于如何敏锐的发现这自然宝藏的价值所在，看得比别人远，下手比别人早，而且动作比别人快。
   自然界有很多宝藏，怪不得venter要下海去找。我们可以不去找，就盯着那些出土的，嗅觉灵敏，慧眼识珠，有了make a difference的机遇，果断抓住！
希望再有这样的好“戏”，我们不但在台上，唱的还是高潮部分~

长长的路

泻药
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）就是细菌体内的一串DNA序列，CRISPR系统还包括了一系列与之功能相关的蛋白。
CRISPR在细菌体内本来是起适应性免疫作用的（有点像人的获得性免疫）。细菌也是会被得传染病的嘛。细菌被病毒感染了，当然也不会束手就擒。病毒感染细菌，对于细菌而言就是细胞内多了一些不是自己的DNA序列，这些序列可能表达出一些对细菌本身有害的的蛋白，所以细菌只要把这些外来的DNA破坏掉就可以了。
CRISPR就是这么一套很巧妙的系统。它先把外来DNA的片段整合进细菌自己的基因组，然后转录出RNA，经过一些剪切之后，利用这些RNA把带有DNA内切酶活性的Cas蛋白直接引导到外源序列的位置，于是，外源DNA就可以被剪断。对于细菌而言，就完成了对外来病原体的快速精确打击。这些整合进基因组的序列还可以传给子代细菌（要是人的免疫可以这么遗传，就不用每个小孩都拉去打疫苗了），所以CRISPR现在也被用作微生物分类的一个依据。
至于最近很火的CRISPR技术其实是利用了CRISPR系统中的RNA引导Cas蛋白去切断目标DNA的这一个步骤。如果破坏的是自己的基因，不就是达到了基因敲除的作用了嘛。
当然CRISPR的爆红主要是还是因为这套技术好用，一方面是省时间，一方面是精度高。省时间是因为要达成基因敲除的目的，只需把两段序列导入细胞就大功告成了。一段序列是Cas9蛋白的基因，它是可以切断DNA双链，就算是DNA有甲基化也照样切。另一段用来转录一条RNA，前一部分是与目标基因配对的，后一半用来与蛋白结合，这样就把Cas9拉过来，切断目标基因。切断了之后，对于真核细胞，各种修复手段就上了，结果通常是基因中间被插入或者删除了几个碱基，这样整个基因的编码就全乱了，基因也就没有原来的功能了，也就是完成了基因敲除。至于精度嘛，20个碱基的长度定位一个基因一般是没问题的，还有就只能感叹Cas9这个蛋白的神奇了。
还有更神奇的，如果把Cas9蛋白的DNA内切酶活性灭掉，再给它加上别的催化活性，它就可以有别的功能。目前，抑制和促进基因表达都可以做到了。

啊？提问里还有意义？
呆逼理科生最不会写意义之类的东西。
个人觉得CRISPR首先是一个很好用的系统，在基础研究上可以为研究人员节约不少时间，提高产出效率，也节约了科研经费。那都是纳税人的钱呀！
还有，CRISPR提供了一个应用面很广的技术平台，多种基因操作和调控都可以通过对CRISPR系统的优化来实现，应用前景一片大好。至少现在看来是很好。现在科研也是一个不小的市场，而CRISPR很有可能就是即将改变这个市场格局的技术。科研上用好了，自然会被用到工业和农业上。
至于临床应用，肯定是用很长一段路要走的啦。赞成
@Zhou Ziliang 的看法。
平安夜码字求点赞！圣诞快乐！

大力水手

• CRISPR ; 规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。现在使用的CRISPR/cas 9系统是由最简单的type II CRISPR改造而来，该系统由单链的guide RNA和有核酸内切酶活性的Cas 9蛋白构成。下图解释其机理：(RE C, SCIE E O F, SOU E. The CRISPR craze[J]. 2013.)
  
• 有什么用？通过cas9蛋白形成DNA双链的断裂，而细胞通过NHEJ的修复会造成INDEL效应（insertion and deletion），进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。此外，还可以通过同源重组等方式达到对基因精确编辑的目的。其实，在此之前已经发展了多种基因的编辑工具，如：ZFN，TALEN等，并且也已经得到广泛应用。CRISPR则相对较为简单，廉价，高效，而且可以多处打靶。下图解释了几种基因编辑方式：(Pauwels K, Podevin N, Breyer D, et al. Engineering nucleases for gene targeting: safety and regulatory considerations[J]. New biotechnology, 2013.)此外，在内切酶活性失活的cas9蛋白后加入KRAB/VP64等effector形成融合蛋白，可对下游基因其调控作用，如下图所示：(Gilbert L A, Larson M H, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J]. Cell, 2013, 154(2): 442-451.)
  
• 怎么用？这一点就应该要看是出于什么目的了，如果是对于细胞的编辑可通过导入编码guide RNA和Cas 9的质粒；若是做动物模型一般则是显微注射RNA。addgene上有现在个实验室开发出来的载体：Addgene: CRISPR/Cas Plasmids for Genome Editing至于怎么用于基因治疗，我就不是很清楚，这部分还是由大神来答吧。基因治疗可参考这个问题：能否利用 DNA 的重新编程治疗遗传病或解决人类进化过程中的缺陷？
  
• 意义CRISPR可谓是2013年生物界的焦点，这项技术相对与ZFN,TALEN等基因打靶技术可以说是简便，经济得多，一般的实验室都可以构建自己的平台。如果要应用于临床治疗中，其脱靶效应应该是最应该解决的问题。如Zhou Ziliang所说，用于临床治疗应该还有一段距离。
  

清风寡欲

谢邀。以前conditioned gene knock-out是要用loxp和cre这两个搭档的，CRISPR出现后好像是更方便（号称one step）而且可以同时target多个基因，而且可以修改后用于片段的插入改写，不限于删除。我记得校内有个帖子review过这个玩意。这里给出连接
http://blog.renren.com/blog/247884829/917457936，希望有所帮助。通俗地来说，能编辑人类细胞的基因组片段了，删除插入改写碱基好像都ok。
2013年这个技术爆发了多篇CNS文章，从酵母细菌到人类细胞，不仅能编辑而且能筛选，实乃实验室必备技术了。好像有位发现者还开了家公司了已经。人类有一些疾病是遗传病，其中又有些是单基因遗传病，要是能做到全身或者至少表达这个基因的细胞内的特异性编辑，可能就能治愈这些疾病。但是，至少先要解决off target的问题，然后还有很多期的临床试验。想想23andMe现在都受到FDA的管制了，直接in vivo编辑人体细胞DNA以用于临床我想还是有很长距离，10年之内能成功就不错了。
鉴于平安夜，暂时就不查review链接了，我想明年肯定好多好多篇...这里给出我搜到的挂网上的全文，虽然不是review，但可以在intro和discuss里面找找作者自己号称的种种好处，就当看广告吧
http://bms.ucsf.edu/sites/ucsf-bms.ixm.ca/files/20131031.kostova.kamena.pdf