三类多重PCR的技术（一）

风云

多重 PCR (Multiplex polymerase chain reaction，MPCR) 是指通过一次 PCR 反应同时对多个靶标进行扩增，结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。MPCR 具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。
目前 MPCR 技术已被广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域，文中从 MPCR 扩增与检测两方面概述了 MPCR 技术发展及其应用，讨论了 MPCR 技术的优点及存在的问题，并且提出将反应体系分隔成小液滴或结合管式对流 PCR (Capillary convective PCR，CCPCR) 技术的方式有望提高固相载体表面的扩增效率，从而开发出扩增效率高、一致性好、体系稳定、检测重数高的多重 PCR 技术。传统的多重 PCR (Multiplex polymerase chainreaction，MPCR)是在普通 PCR 的基础上，在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段，结合一定的检测手段进而实现同时对多个靶标进行诊断的技术。自Chamberlain [1] 于 1988 年首次提出这个概念以来，MPCR 已经应用于许多领域，包括基因突变与缺失、基因分型与定量、遗传检测、伴药诊断等 [2-6] 。MPCR 所涵盖的范围广，能够同时对多个靶标进行检测，大幅提升检测效率的同时，还降低了检测成本。
随着科学技术的发展，MPCR 技术在扩增和检测方面已经取得了许多新的突破。在扩增方面，不再局限于在同一反应管中进行扩增，而是将不同的引物对和模板分散于相对独立的空间中进行扩增；在检测方面，不断有新的超多重检测技术的出现。文中从 MPCR 扩增与检测两方面概述了 MPCR 技术的发展及其应用，对影响 MPCR 扩增与检测效果的因素进行了总结，并对提高固相载体表面的扩增效率提出针对性策略。

01

多重荧光定量 PCR 技术

1.1 基于荧光探针的多重 PCR 技术

多重荧光定量 PCR (Multiple fluorescencequantitative PCR)技术是在荧光定量 PCR 技术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。

TaqMan 水解探针 (Hydrolysisprobes) 是多重荧光 PCR 体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的 TaqMan 水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。

Weller等 [7] 以 TaqMan 探针为基础，成功构建了两重 PCR扩增和检测体系，Zhang 等 [8] 通过单管逆转录反应成功地实现了对肠病毒 71 型 (EV71)、柯萨奇病毒 A16 (CA16) 以及总肠道病毒 (EVs) 的三重检测。

分子信标 (Molecular beacon) 是多重 PCR 体系中另一种常用的探针，基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET) 的原理，当体系中不存在特异性的靶标时，分子信标会自发形成茎环结构，淬灭基团与荧光基团相互接近从而发生 FRET，不会产生荧光。

如果体系中存在特异性的靶标，在一定的条件下，茎环结构会打开并且与靶标进行复性，从而产生荧光信号。那么在同一个反应体系中加入几种靶标特异性的分子信标就能够实现对多个靶标的同时检测。Vet 等 [9] 针对 4 种不同的靶标设计了 4 种不同的分子信标并且首次在四色荧光 PCR 仪上实现了四重的检测，El-Hajj 等 [10] 利用五色分子信标探针实现了对结核杆菌利福平耐药突变的检测。

1.2 基于探针编码的多重 PCR 技术

基于水解探针和分子信标探针的多重荧光定量 PCR 技术的优点是简便快捷，然而受仪器荧光检测通道的限制，往往最多只能达到四重或五重检测。

组合探针编码 (Combination probecoding) 技术的开发，使得目前的多重实时核酸扩增可检测的靶标数目多于仪器可检测的数目。通过对 4 种不同的荧光基团进行相互组合可以形成15 种指示探针 (图 1)，在多重反应体系中加入多种靶序列特异的置换探针 (Displacing probes)，那么在检测通道有限的情况下仍能够实现对多种不同的靶标同时进行扩增和检测。

Huang 等利用多色组合探针编码技术 (MCPC) 实现了对 8 种食源性病原菌的鉴定以及通过 4 色组合探针编码技术实现了对 15 种不同型别的 HPV 病毒进行分型 [11-12] 。

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