流式细胞术中，淋巴细胞的圈门问题

非诚勿扰孟非

我们在做实验的过程中，因为实验的需要，我们需要圈定不同的细胞群体。例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞。那么我们应该如何在第一张物理散点图中圈选正确的细胞群体，从而避免功亏一篑。
<hr/>不同细胞的方法

• 悬浮细胞——直接收集细胞，离心沉淀后，用PBS重悬沉淀后，将适量的细胞放置到EP管中，随后进行染色
  
• 贴壁细胞——胰酶消化后，用培养基或PBS反复吹打，收集待测的样本细胞，离心后标记荧光素偶联抗体
  
• 外周血单个核细胞——包括T细胞、B细胞、NK细胞、 单核细胞。最常用的实验方法是Ficoll密度梯度离心法
  
• 中性粒细胞——使用红细胞裂解液裂解红细胞
  

我们今天着重来讲解一下外周血单个核细胞的流式过程
Ficoll密度梯度离心法步骤

• 抽取适量的血液于离心管中，该离心管需要事先加上抗凝剂（一般如收取临床检测标本，其管壁上以有抗凝剂）；
  
• 使用PBS稀释血液，稀释倍数一般根据血液的浓稠度来调整，一般以2-4倍为宜；
  
• 根据稀释后的血液总量选择15ml离心管或者50ml的离心管，先加入离心管1/4左右体积的Ficoll分离液，然后慢慢将稀释后的血液小心叠加到Ficoll分离液的上层，体积是Ficoll液体积的2.5-3倍为宜；
  
• 离心管置于离心机中，缓升缓降离心20min
  
• 此时，离心管中液体分为3层，上层为血浆，中层为含有PBMC的Ficoll，最下层为红细胞。在拿出的过程中需要注意轻拿轻放，不可将分层的液体重新混合
  

分层示意图

• 将用吸管吸取得到的PBMC的中层Ficoll液置于新的离心管中，用PBS稀释，至少稀释一倍。如不稀释，离心时则无法有效沉淀PBMC。（原因：PBMC的密度小于Ficoll液，如不经稀释直接离心，则PBMC仍然存在于Ficoll分离液上层）
  
• 低速离心10min，使得PBMC沉淀，而血小板悬浮于上层液体之中，弃去含有血小板的上层液体
  
• PBS重悬PBMC沉淀，中速离心5min，沉淀为PBMC
  

流式圈门

笔者在刚开始做Treg细胞的流式染色的过程中，由于缺乏经验，在第一张物理散点图上，将所有细胞圈门，于是出现了较为怪异的现象



物理散点图



CD4+Foxp3+

中间出现了一群不知名的细胞群体。由于本人一开始错误的认为下面一群细胞是细胞碎片，所以一直未能消除此细胞群体。
在经过资料查询后，笔者发现，淋巴细胞群体就是下面一群细胞。理由如下

• 单个核细胞中，主要包括淋巴细胞和单核细胞，中性粒细胞已经被排除
  
• 淋巴细胞的细胞大小小于单核细胞
  

物理散点图



CD4+Foxp3+

总结

• 由于Treg细胞的经典标志物为CD4+CD25+Foxp3+，因此需要对细胞进行破核膜后，染Foxp3。细胞的物理散点图与通常所见的物理散点图出现明显的区别，不能够明显的分为两群；
  
• 如需要淋巴细胞，我们应该圈出体积较小的这群细胞。
  

<hr/>今天的分享就到这里，希望各位能指出本人所分享中的错误。

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