免疫荧光？

莺歌燕舞

有没有做免疫荧光实验的，
原文地址：https://www.zhihu.com/question/59509205

检验医师

多标记免疫荧光方法是现代生命科学研究中一项革命性的技术，它不仅提供了高度灵敏度和特异性的细胞成像手段，还为科学家们开辟了全新的探索领域。http://www.pinuofei.com
武汉市皮诺飞生物科技有限公司
提供科研生物实验技术服务、配套试剂、仪器与耗材销售，为生物院校、科研单位、生物医药类公司提供整体与单独实验解决方案的高新技术企业。经营范围：石蜡包埋、切片（冰切）、染色、IHC、IF、WB、PCR、FISH、IP、COIP、生化检测（手动生化、elisa、上机生化)、SEM、TEM、整体课题动物、细胞实验、组织芯片等。本文将深入探讨多标记免疫荧光方法的原理、应用和未来发展方向，带领读者一同探索这一令人着迷的科学工具。

多标记免疫荧光方法的原理与优势



多标记免疫荧光方法的原理与优势

多标记免疫荧光方法利用荧光染料标记特定的生物分子，通过荧光显微镜观察这些分子在细胞或组织中的分布和相互作用，从而揭示生命活动的细微变化。与传统的单标记荧光方法相比，多标记免疫荧光方法具有多重标记的优势，可以同时观察多种生物分子，实现更全面的细胞成像。

在细胞生物学、免疫学、神经科学等领域，多标记免疫荧光方法被广泛应用于细胞信号传导、蛋白质定位、细胞分化等研究中。其高灵敏度和高分辨率的特点使得研究人员能够准确观察细胞内各种生物过程，为科学研究提供了强大的技术支持。

多标记免疫荧光方法的应用领域



多标记免疫荧光方法的应用领域

多标记免疫荧光方法在生命科学领域具有广泛的应用前景。在细胞生物学研究中，它可以帮助科学家们研究细胞器的分布和相互作用，揭示细胞内复杂的调控机制。在免疫学领域，多标记免疫荧光方法被运用于免疫细胞的鉴定和功能研究，有助于深入理解机体的免疫应答机制。在神经科学领域，多标记免疫荧光方法可用于神经元的形态学分析和突触传递研究，为神经系统疾病的治疗提供重要线索。

除此之外，多标记免疫荧光方法还在肿瘤学、感染病学、发育生物学等各个领域展现出强大的潜力，为科学研究提供了全新的视角和方法学。

多标记免疫荧光方法的未来展望



多标记免疫荧光实验

随着生命科学领域的不断发展，多标记免疫荧光方法将会迎来更广阔的应用前景。未来，随着荧光探针、成像技术的不断改进，多标记免疫荧光方法将实现更高的分辨率和更全面的多重标记，为研究人员提供更加精准、深入的细胞成像数据。同时，随着人工智能、大数据分析等技术的融合，多标记免疫荧光方法将更好地发挥其在生命科学研究中的作用，助力科学家们揭示生命活动的奥秘。

综上所述，多标记免疫荧光方法作为一种强大的细胞成像技术，正在推动生命科学研究迈向新的高度。未来，随着技术的不断革新和方法学的不断完善，相信多标记免疫荧光方法必将发挥越来越重要的作用，为人类认识生命、治疗疾病、探索未知领域带来更多惊喜和突破。

清风寡欲

作为一名病理染色技术方面的老技工，今天跟大家分享一下笔者对免疫染色中抗原修复方法的经验与体会。
相信很多同行会遇到这种问题，qPCR或者转录组测序检测到目的基因明显上调，而免疫荧光或免疫组化却显示目的蛋白为阴性，又或者是石蜡切片能染出目的蛋白而冰切阴性。事实上，这种情况大多数都是由于抗原修复不充分或者没有进行抗原修复。换句话说，进行充分的抗原可修复往往可以改善上述情况。
要讲清楚其中的原理，我们得先说一下切片制备前的取材过程。由于活细胞在缺氧等情况下会启动凋亡或坏死程序，其中伴随溶酶体释放蛋白水解酶的过程，为了减少蛋白降解，我们往往会先对麻醉的动物进行经心灌注后取材。操作是先灌注预冷的PBS或者生理盐水（一是赶走血管腔的红细胞以减少自发荧光效应，二是降低体温而抑制水解酶的活性），再灌注预冷的4%多聚甲醛溶液（交联蛋白保护抗原），然后摘取组织器官，接着将组织器官浸泡于不少于组织体积10倍的4%多聚甲醛溶液中进行后固定（不超过24小时），然后才是脱水包埋切片。
上述的4%多聚甲醛溶液之所以能固定蛋白质，是因为醛基作为活性基团，可以交联蛋白质的氨基酸残基，封闭水解酶的结合位点，减少水解酶对其进行水解，从而稳定蛋白质的肽链结构。当然，这个过程也封闭了抗原表位，阻碍了抗原抗体的结合反应，所以，凡是经过了醛类固定剂固定过的组织，在进行免疫反应之前都需要经过充分的抗原修复。以前，更常见的冰冻切片制样前的取材是没有多聚甲醛进行灌注和后固定的，新鲜标本取材，后固定采用丙酮或甲醇。所以，很多同行的传统观念认为，石蜡切片需要抗原修复，而冰冻切片无需抗原修复。其实这是不准确的，具体应该是，没经过醛类固定液处理的组织切片不用进行抗原修复。
抗原修复方法多种多样，有热修复（微波炉和高压锅），酶修复，但目的都是为了解开蛋白的交联，暴露更多抗原表位。抗原修复液也有多种，有酸性的（柠檬酸钠），也有碱性的（EDTA）。一般来说，温度越高，修复液pH越高，修复越彻底。但不是温度和pH越高越好，因为这样也更容易脱片或者切片发生糜烂、碎裂。
顺便提一下关于一个经常被问及的问题：免疫组化或荧光的抗体如何选择？抗体官网如果标明IHC-P，P是石蜡Paraffin的缩写，那么说明这个抗体适用于经过醛类固定剂处理的组织，不管石蜡切片还是冰冻切片，不管是免疫组化还是免疫荧光都可用。如果标明的是IF，则提示说明这个抗体适用于未经过醛类固定剂处理的组织，一般是新鲜冰冻切片，石蜡切片可能不适用。
关于各种抗原修复液和固定液的配制、抗原修复的加热方案，笔者有较为成熟具体经验可借鉴，有需要的可以留言。
分享一下最近帮助同行的故事。


这是个硕士一年级的同行，由于师兄师姐对他的实验技术不信任，叮嘱他不能随便更改实验条件。但是他按照课题组原有的经验总是染不出冰切片子的几个目的蛋白，失败多次后到网上找资料，然后看到了我的经验帖子，感觉似乎有点用，就抱着试试的态度来咨询我。 然后他偷偷改变了实验条件。
我听了他的经历后，想起我刚上研究生时，为了染血管周细胞的marker，尝试了CST，abcam和R&D多个抗体也无果，后来花了大概半年才找到原因，原来是抗原修复液的问题，最后终于染了出来(本人头像右上图)，并且摸索出了一个非常有效的抗原修复液配方。其中的煎熬我至今难以忘怀。也正是为了让更多同行不用走类似的弯路，后来我用这个配方帮助了很多同个实验室的同学以及网上咨询的同行。
​同样的，我继续用我的配方解救了上述这个同行，只花了一周左右的时间，就把他们课题组历史以来的冰切免疫荧光难题解决了。
为了更好地解决大家的问题，本人已开通微信（_17665739136）在线答疑，可语音或者腾讯会议，付费进行，每30分钟50元。
此外，笔者还有其他科研经验和知识文章分享，请需要的人点击以下链接自取：
1、Western blot实验技巧之蛋白样品制备、SDS-PAGE胶制备、跑电泳、转膜、孵育抗体、显影和ImageJ分析（来自一位可稳定重复WB结果的科研狗之四年经验总结） - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/604974774
2、石蜡切片和冰冻切片之高质量HE染色、免疫组化、免疫荧光染色 - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/605116889
3、使用Chat GPT润色英文论文是否会泄露文本，是否符合科研规范，是否增加查重率？ - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/608810966
4、western blot 内参问题? - Doctor Chao的回答 - 知乎 https://www.zhihu.com/answer/2934376418
5、Image J 统计免疫组化片子阳性信号的平均光密度值教程 - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/613052671
6、组化片子如何利用Image J 进行阳性信号面积占比统计分析 - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/614030478
7、期刊实时影响因子计算（保姆级教程） - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/614058857
8、石蜡切片实验中的毒物（苯和二甲苯）与白血病的关系——发病机制 - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/626963970
9、不安腿综合征之知识科普(发病机制) - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/652938986
10、帕金森病四大运动症状的病理生理机制解释——超级通俗易懂且前沿 - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/656317211
11、为何我国阿尔茨海默病患者呈年轻化增长趋势？ - Doctor Chao的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/657662508
12、SDS-PAGE凝胶制备技巧，易翻车点及其解决方法汇总（五年经验结晶）
13、攻克神经变性病：一文讲清免疫组化结果到底该选择阳性面积占比，平均光密度值，累积光密度值还是其他分析方法——ImageJ

清风寡欲

实验技能分享免疫荧光

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术。它的原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内的特定抗原进行定位和定性的分析。IF是一个很好的检测技术工具，用于研究感兴趣的产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移。
免疫荧光检测方法

直接免疫荧光：携带荧光素的抗体直接与抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物。该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。




间接免疫荧光：先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。（实验室最常用的方法）。




间接免疫荧光主要介绍

间接免疫荧光试验的主要步骤包括制备样品、固定、通透、封闭、以及一抗和二抗的孵育和最后的激光共聚焦拍照。

1.  细胞准备
将细胞接种于加有爬片的24孔板中，待细胞长到合适的密度进行样品的处理。密度太大，会造成细胞过于拥挤，形态不佳且边界不清，并且导致染色背景过深。如果细胞过少会导致细胞活性不佳，从而易发生非特异性染色，因此，染色时细胞密度最好在60%-70%左右。

2. 固定
使用4%的PFA室温固定30min。固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用，适用于研究细胞膜蛋白。




3. 通透
固定结束后，用1×PBS洗三遍后，加入0.1%TritonX-100 100μL/片，室温通透10min。通透的目的是在细胞膜上打孔，让抗体进入细胞内于抗原结合。

4. 封闭
通透结束后，用1×PBS洗三遍，加入10% FBS PBS 100 μL/片进行封闭。封闭是为了放置内源性非特异性蛋白抗原结合。




5.  一抗孵育
将相应的一抗用10% FBS PBS以1：500稀释比例进行稀释，加入稀释好的一抗100μL/片。室温孵育1h。




6. 二抗孵育
1h结束后，用1×PBS洗三遍，将与一抗同种属的二抗用10% FBS PBS以1：500或1：1000的稀释比例进行稀释。加入稀释好的二抗100μL/片。室温孵育1h。




7. DAPI染核
二抗孵育结束后，用1×PBS洗三遍，加入DAPI100μL/片，室温染核10min。

8. 封片
封片：染核结束后用1×PBS洗三遍，然后用超纯水洗三遍，在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片弃干水后轻轻倒置放于载玻片上，室温避光干燥，-20℃保存。




9.利用激光共聚焦显微镜拍照
注意事项：
一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要匹配，二抗不能有交叉反应；
从孵育二抗开始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果；
洗涤过程中，动作要轻柔，防止把细胞吹洗掉；
选择合适的细胞密度进行试验。

清风寡欲

实验技能分享免疫荧光
免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术。它的原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内的特定抗原进行定位和定性的分析。IF是一个很好的检测技术工具，用于研究感兴趣的产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移。

免疫荧光检测方法
直接免疫荧光：携带荧光素的抗体直接与抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物。该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。




间接免疫荧光：先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。（实验室最常用的方法）。




间接免疫荧光主要介绍
间接免疫荧光试验的主要步骤包括制备样品、固定、通透、封闭、以及一抗和二抗的孵育和最后的激光共聚焦拍照。

1.  细胞准备
将细胞接种于加有爬片的24孔板中，待细胞长到合适的密度进行样品的处理。密度太大，会造成细胞过于拥挤，形态不佳且边界不清，并且导致染色背景过深。如果细胞过少会导致细胞活性不佳，从而易发生非特异性染色，因此，染色时细胞密度最好在60%-70%左右。

2. 固定
使用4%的PFA室温固定30min。固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用，适用于研究细胞膜蛋白。




3. 通透
固定结束后，用1×PBS洗三遍后，加入0.1%TritonX-100 100μL/片，室温通透10min。通透的目的是在细胞膜上打孔，让抗体进入细胞内于抗原结合。

4. 封闭
通透结束后，用1×PBS洗三遍，加入10% FBS PBS 100 μL/片进行封闭。封闭是为了放置内源性非特异性蛋白抗原结合。




5.  一抗孵育
将相应的一抗用10% FBS PBS以1：500稀释比例进行稀释，加入稀释好的一抗100μL/片。室温孵育1h。




6. 二抗孵育
1h结束后，用1×PBS洗三遍，将与一抗同种属的二抗用10% FBS PBS以1：500或1：1000的稀释比例进行稀释。加入稀释好的二抗100μL/片。室温孵育1h。




7. DAPI染核
二抗孵育结束后，用1×PBS洗三遍，加入DAPI100μL/片，室温染核10min。

8. 封片
封片：染核结束后用1×PBS洗三遍，然后用超纯水洗三遍，在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片弃干水后轻轻倒置放于载玻片上，室温避光干燥，-20℃保存。




9.利用激光共聚焦显微镜拍照
注意事项：
一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要匹配，二抗不能有交叉反应；
从孵育二抗开始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果；
洗涤过程中，动作要轻柔，防止把细胞吹洗掉；
选择合适的细胞密度进行试验。

继续前进

一、免疫荧光的原理

免疫荧光(Immunofluorescence，IF)技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、IF分类



三、IF实验流程

1）样品准备：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤 (1000rpm、5min) 2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片；
2）固定：4%多聚甲醛(PFA)溶液固定细胞15min，PBS洗涤3遍，每次5min；
3）通透：0.5% TritonX100，通透15-20min，PBS洗涤3遍，每次5min；
4）封闭：3%牛血清蛋白(BSA)室温封闭30min-1h ，封闭的作用是可以减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本底信号；
5）抗孵育：封闭过后，不用洗，直接将多余的BSA吸走，用稀释后的一抗（用3% BSA稀释）4度过夜孵育;
6）二抗孵育：PBST洗涤3遍，每次5min，洗去未结合的抗体。而后用稀释后的二抗（用3% BSA稀释）室温避光孵育1h，PBST洗涤3遍，每次5min；
7）细胞核染色：滴加DAPI避光染色5min，PBS洗涤3遍，每次5min（染细胞核是为了定位细胞）；
8）拍照：立即用激光共聚焦或荧光显微镜进行拍照，如果需要等待，则避光放在4°保存。
四、检测方法

检测方法分为直接检验和间接检验，我们一般多采用间接检验（一抗+二抗）的方式。


五、免疫荧光双染

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色双重免应焚光标记法也分为直接法和间接法。
1）直接法：将两种不同荧光素偶联的抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，样本孵育，润洗，封片，镜检；
特点：简便可靠，不需要考虑一抗种属来源的问题，但灵敏度较低。
2）间接法：用未标记的两种一抗薄育样本，润洗后，加入两种不同的荧光素偶联的对应二抗辩育样本，润洗，封片，镜检；
3）特点：使用此法应注意两种特异性一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要相匹配。
六、IF注意事项

1）固定时间影响荧光固定效果，针对细胞样品，如果用4%多聚甲醛固定，推荐固定时长15min，时间太短没有达到固定效果时间太长会导致甲醛被氧化成甲酸，没有固定作用了；
2）保持醛固定液新鲜，否则自发荧光背景会升高；
3）使用抗体时，需要查询说明书。因为不同抗体使用场景不一样，确认抗体是否能用于细胞IF、冰冻切片IF、 石蜡切片IF；
4）细胞密度是整个实验能否成功的关键点之一。如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果；
5）洗涤过程轻柔，防止加液过程冲力过大丢失细胞；
6）通透时间一般为15-20min，过短过长效果均不好，应做不同时间梯度摸索。
七、IF常见问题总结


1）信号微弱或没有信号

可能原因1：目的蛋白需要诱导表达或者表达量低；
解决方法：对于需要诱导表达的蛋白，参考文献找到诱导蛋白表达的最佳处理条件和阳性对照；表达量低的蛋白考虑信号扩增，或与更亮的荧光基团配对；在可能的情况下，应使用蛋白印迹法或其他方法来确认蛋白表达情况

可能原因2：样本保存不当。如荧光基团在光线下 暴露时间过长，可能会导致信号衰减
解决方法：在避光条件下进行孵育和保存样本。可在防淬灭的溶液中封固样本。样本封固后要立即采集图像，以获取最佳结果

可能原因3：细胞/组织样本保存时间过长
解决方法：使用新制备的样本载玻片/板

可能原因4：固定不足
解决方法：请参考产品说明书；处理后立即移除介质并在固定剂中快速、彻底地清洗对于磷酸化特异的抗体，使用浓度为至少4%的甲醛来抑制内源性磷酸酶

可能原因5：抗体用量不合适
解决方法：参见说明书建议的抗体稀释浓度，并根据样本表达量进行摸索

可能原因6：一抗孵育时间不合适
解决方法：建议在4度过夜孵育以获得最佳结果

可能原因7：错误的通透方法
解决方法：参见产品说明书中建议的提作步骤

可能原因8：二抗使用不当
解决方法：按建议浓度使用，检查二抗是否与一抗的宿主物种相匹配

可能原因9：错误的激发波长
解决方法：确保激发和检测(激光/激发/发射滤光器)与荧光基团激发光波长相匹配

2）高背景

可能原因1：封闭不充分
解决方法：使用与二抗相同物种的正常血清，封闭1h

可能原因2：抗体使用浓度过高
解决方法：参考说明书推荐浓度，并根据蛋白表达量进行优化

可能原因3：抗体育时间过长或孵育温度过高
解决方法：参考说明书推荐的孵育时间和温度

可能原因4：样本变干
解决方法：染色过程中，确保样本始终彻底漫没在液体中

可能原因5：清洗不足
解决方法：清洗以移除多余固定剂、多余二抗，以及结合松散、非特异性的抗体相互作用

可能原因6：样本自发荧光
解决方法：以未染色样本为对照，检测自发荧光程度。参考说明书推荐的固定剂，用久了的固定剂可能会出现自发荧光。更换陈旧甲醛、制备新鲜的稀释液。使用在安瓶中新稀释的、可用于电子显微镜（EM级）的戊二醛。为低丰度靶标选择较长的波长通道

可能原因7：非特异性抗体结合
解决方法：如可能，请与敲低(siRNA)或除细胞，或与已知靶抗原表达水平较高或较低的细胞进行比较

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