生物化学关于酶活力单位和比活力的计算？

病理医师

求问第四题


原文地址：https://www.zhihu.com/question/39545618

长长的路

先用数据，双倒数做个图，用软件添加趋势线，列出公式：


另1/[S]=0，则：
1/Vmax=0.014
也就是Vmax=71.43mmol/L·min
10ml的体系，以最大反应速率反应1小时（60分钟），则产物应为71.43mmol/L·min ·10ml ·60/1mmol=42.86U
总酶活=42.86/2ml*1L=21428.57U
比酶活=21428.57U/1g=21.43U/mg
如果不能用电脑/软件来模拟作图，那么就会复杂一点，这个你可以问数学老师，怎么来拟合曲线（手动）。
不过一半应该不会让学生这么干吧？
亦或者你在试卷上手动绘制曲线，然后大约计算纵坐标截距，大致是可以估算的，虽然可能不太准，但是应该也不至于有数量级的差别。
此外，根据米-曼氏方程：


当1/[S]=0，也就横坐标截距的值为：
-1/Km ,也就是说，此时的可以计算出Km值，即2.35*10（-5）mmol/L。

队长是我

PART.01研究背景

选择性氧官能化反应是有机合成界的“圣杯”，尤其是立体选择性地对未活化的C-H键进行反应难度更甚。通过酶工程获得理想的生物催化剂是近年来的研究热点。传统的酶工程如定向进化依赖于高通量筛选手段，对于一些必须使用低通量分析手段的酶催化反应有较大的局限性。近年来，人工智能在酶工程领域的应用有了长足的发展，Rosetta等计算机辅助工具为蛋白质工程提供了强有力的参考。Fleishman团队设计的Funclib工具，综合了Rosetta建模和进化保守性分析，是设计功能化酶库的强助力。
近日，西班牙高等学术理事会的Miguel Alcalde团队发表了题为Repertoire of Computationally Designed Peroxygenases for Enantiodivergent C–H Oxyfunctionalization Reactions的文章，作者选取了非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO）作为研究对象，使用Funclib工具辅助设计了一个仅包含30个突变体的酶库，实现了对该酶的立体性选择、区域选择性的改造（图1）。




图1 Funclib辅助设计UPO酶库



PART.02研究过程

首先，作者选取了此前已进行过稳定性优化的UPO——PaDa-I进行进一步的改造。作者依据PaDa-I的晶体结构，认为其血红素通道中的氨基酸残基对立体选择性有影响，因此作者选取了其中15个氨基酸作为突变位点，提交Funclib分析。在分析结果中，作者选取了能量最低的22个突变体，以及算法认为有益的8个突变体，组成了酶库（表1）。作者在酵母体内表达了这30个突变体，经显色实验验证，获得了24个功能性表达。




表1 FuncLib设计的氨基酸残基位置及其相应的氨基酸取代


随后，作者使用顺-β-甲基苯乙烯、反-β-甲基苯乙烯、苯乙烯、乙苯、1,2,3,4-四氢化萘作为底物，检验上述突变体的催化活性。对于顺-β-甲基苯乙烯、乙苯、1,2,3,4-四氢化萘三个底物，突变体d8，d14，d18，d28展现出了与PaDa-I相反的立体选择性；对于乙苯，d1，d2，d3，d4，d5，d7，d8，d10，d13，d14，d18，d30展现了与PaDa-I不同的区域选择性，产生了新的产物。对于反-β-甲基苯乙烯和苯乙烯，PaDa-I本身的立体选择性不强，但是突变体d2，d3，d4，d7，d8，d12，d14，d15，d18，d19，d25，d26，d28和d29的立体选择性均有改善（表2）。




表2 FuncLib设计蛋白催化产物的立体和区位选择性与PaDa-I的区别


接着，作者选取了表现较为优异的d2，d4和d28进行了表达和纯化，测定了其一些理化常数并与PaDa-I进行了比较。可以看出d2，d4，d28的亲和力均有很大提高，但是在催化效率上有一定下降。综合来看，kcat/Km值均有提高，d4提高了10倍。值得一提的是，d4在pH值3.0到9.0范围内均可稳定催化，表现出了良好的pH耐受性（表3）。




表3 PaDa-I和d2，d4，d28的理化常数对比



最后，作者用分子对接解释了突变体催化活性改变的机制。对于底物1a，d28的A77I，F69L和G241M重塑了酶的活性中心，使得1a在其中的取向发生了变化，因此催化产物呈现出了与PaDa-I不同的立体构型（图2a）；对于底物5a，d28的一系列突变影响到了底物与血红素以及保守位点的相对位置，故而使得立体选择性发生改变（图2b）；底物2a和3a在d2和d4的活性位点中，取向角度相差了约45°，故产物呈现出相反的构型（图2c, d）。




图2 不同底物与PaDa-I和d2，d4，d28的分子对接研究



PART.03研究总结

本文中，作者使用了Funclib构建了一个30个突变体的酶库，大大减少了湿实验的工作量。这是计算机辅助的出发点和落脚点。值得注意的是，Funclib虽然具有强大的功能，但是并不能针对某一个底物或某一种功能实现改造，产生的突变体酶库也是为后续的工作提供了一个“开端”。如果说UPO是一个可以赢得“圣杯”的勇士，那么本文中，Funclib无疑是这位勇士的利剑。随着计算设计工具和算力的进一步发展，准确度得到进一步的提高，湿实验工作量也可以进一步减少，对于缩短实验周期，降本增效具有很重要的意义。

参考文献
http://1.de Santos, P. G.; Mateljak, I.; Hoang, M. D.; Fleishman, S. J.; Hollmann, F.; Alcalde, M., Repertoire of Computationally Designed Peroxygenases for Enantiodivergent C-H Oxyfunctionalization Reactions. J Am Chem Soc 2023, 145 (6), 3443-3453.
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编译：江淮之间
编辑：LIU


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检验医师

一、酶活力的测定
1. 酶活力
（1）酶活力定义
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力大小用在一定条件下所催化某一反应的反应速度来表示。反应速率越大，活力就越高，反应速率越小，酶活力就越低。酶活力测定实际上就是酶的定量测定。
（2）酶促反应速度
酶促反应速度:用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示（单位:浓度/单位时间)。
随着反应时间的延长，酶反应速度降低，研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准的原因：
① 底物浓度降低；
② 产物浓度增加加速了逆反应的进行；
③ 产物对酶的抑制或激活作用；
④ 随着时间的延长引起酶本身部分分子失活。
所以，研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。
2. 酶的活力单位（U）
（1）酶活力单位又称酶单位，表示酶活力的大小（即酶含量的多少），是指在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量；
（2）采用统一的国际单位（IU）来表示酶活力，规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个酶活力单位，即1 IU＝1 μmol／min；
（3）另一种新的酶活力国际单位Kat（简称Kat）单位，规定为：在最适条件下，每秒钟能催化1摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量，定为1Kat单位（1Kat＝1mol/s）。Kat单位与IU单位之间的换算关系如下：
1Kat=60×106 IU
1 IU＝1/60μ Kat＝16.7 nKat
3. 酶的比活力
酶的比活力代表酶的纯度，根据国际酶学委员会的规定比活力用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一种酶而言，比活力大，表示酶的纯度意高。比活力＝活力IU／mg蛋白＝总活力IU／总蛋白mg
例子：某酶粗提液经一次纯化后测得数据如下


计算经纯化后酶的: （1）比活力; （2）纯化倍数; （3）回收率。
解:
（1）比活力=300×5÷10=150 IU/mg蛋白（总活力IU/总蛋白mg）
（2）纯化倍数=300÷20=15(倍)（纯化后的总单位体积活力÷纯化前单位体积活力）
（3）回收率=300 ×5÷(20×100)×100%=75%（纯化后的总活力IU÷纯化前的总活力IU）
4. 酶活力的测定方法
（1）通过两种方式可进行酶活力测定
① 终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化
② 动力学法:连续测定反应过程中产物、底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。
（2）测定酶活力就是测定产物増加量或底物减少量，主要根据产物或底物的物理或化学特性来决定具体酶促反应的测定方法。
① 分光光度法
利用底物和产物在紫外或者可见光部分光吸收的不同而建立起来的方法。几乎所有的氧化还原酶都可以用此法测定。
② 荧光法
利用底物或者产物有荧光变化而建立的方法。灵敏度很高，但是检测容易受干扰，必须严格控制实验反应条件。
③ 酶偶联法
讲没有光吸收或者荧光变化的酶反应与能引起光吸收或荧光变化的酶反应偶联，即第一个酶的产物作为第二个酶的底物，通过第二个酶反应产物的光吸收或荧光变化来测定第一个酶的活力的方法。
④ 电化学法
根据反应中底物或产物的不同电学性质而设计的一些方法，是一类连续分析法，灵敏度和准确度很高，但是此法要求一定的仪器设备。
二、酶的分离和纯化
1. 酶的提纯两个方面
（1）把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积；
（2）把酶制剂中大量的杂蛋白和其他大分子物质分离出来。
2. 判断分离提纯方法的优势
（1）总活力的回收：是表示提纯过程中酶的损失情况；
（2）比活力提高的倍数：表示提纯方法的有效程度。
3. 生物细胞产生的酶分类
（1）胞外酶是由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用的酶，这类酶大多都是水解酶类；
（2）胞外酶是指在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而是在细胞内起催化作用的酶，数量较多。
4. 酶分离纯化应注意事项
（1）选材：选择酶含量丰富的新鲜生物材料，酶的提取工作应在获得材料后立即开始，否则应在低温下保存或将生物组织做成丙酮粉保存。
（2）破碎：动物组织细胞通过一般的研磨器、匀浆器、高速组织捣碎机磨碎。微生物及植物细胞需要用超声波、细菌磨、冻融、溶菌酶或用某些化学溶剂等处理加以破碎，制成组织匀浆。
（3）抽提：在低温下，以水或低盐绶沖液，从组织匀浆中抽提，得到酶的粗提液。
（4）分离及纯化：在分离纯化时必须注意尽量减少酶活性损失，操作条件要温和，全部操作一般在0～5℃间进行；每一步都应测定留用以及准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，以了解回收率，纯化倍数，从而决定这一步的取舍。
① 总活力＝活力单位数／ml酶液总体积（ml）；
② 比活力＝活力单位数／mg蛋白（氮）＝总活力单位数／总蛋白（氮）mg；
③ 纯化倍数＝每次比活力／第一次比活力；
④ 回收率（产率）＝纯化倍数×100％。
（5）结晶：通过各种提纯方法获得较纯的酶溶液后，就可能将酶进行结晶。
（6）保存：通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冰冻干燥得到酶粉，低温下可较长时期保存。


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队长是我

纤维素酶是一种多组分酶， 包含C1 酶、 CX 酶和¦Â-葡萄糖苷酶三种首要组分。 其间C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素持续水解成纤维寡糖，¦Â-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等复原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）复原，生成棕赤色的氨基化合物，在540nm  波长处有最大光吸收， 在必定范围内复原糖的量与反响液的色彩强度呈比例关系， 运用比色法测定其复原糖生成的量就可测定纤维素酶的生机。更多这方面的内容生物帮上面有的，分子生物学的运用 http://doc.bio1000.com/show-3438.html4.2 果胶酶生机测定4.2.1 原理果胶酶水解果胶,生成半乳糖醛酸。半乳糖醛酸具有复原性糖醛基,可用次亚碘酸法定量测定,以此来表明果胶酶的活性。4.2.2 试剂和溶液a.果胶粉(Sigma公司出品) 10g/L水溶液称取果胶粉1.0000g,精确至0.0002g,加水溶解,煮沸,冷却。如有不溶物则需进行过滤。pH至3.5,用水定容至100ml,在冰箱中储存备用。运用时间不超越三天;b.硫代硫酸钠规范溶液c(Na2S2O3)=0.05mol/L 按GB 601配制与标定 0.1mol/L溶液。运用时精确稀释一倍;c.碳酸钠溶液c(1/2Na2CO3)=1mol/L 按GB 601配制;d.碘规范溶液c(1/2I2)=0.1mol/L 按GB 601配制与标定,储存于棕色瓶中;e.硫酸溶液c(1/2H2SO4)=2mol/L 取浓硫酸(d=1.84)5.6ml,缓慢参加适量水中,冷却后用水定容至100ml,摇匀;f.可溶性淀粉指示液(10g/L) 按GB 603配制;g.0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)甲液 称取柠檬酸(C6H8O7·H2O)21.01g,用水溶解并定容至1000mL;乙液 称取柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)29.41g,用水溶解并定容至1000ml;取甲液140ml、乙液60ml,混匀,缓冲液的pH应为3.5(用pH计调试)。4.2.3 仪器a.比色管 25ml;b.恒温水浴 50±0.2℃;c.容量瓶 25ml、50ml、100ml、200ml、250ml;d.碘量瓶 250ml;e.吸管 1ml、5ml;f.滴定管 25ml。4.2.4 实验程序4.2.4.1 制备酶液a.固体酶 用已知分量的50ml小烧杯,称取样品1.0000g,精确至0.0002g,以少数柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)溶解,并用玻璃棒捣研,将上清液当心倾入适当的容量瓶中,沉渣再加少数缓冲液,反复捣研3~4次,最后悉数移入容量瓶,用缓冲液定容,摇匀,以四层纱布过滤,滤液供测试用;b.液体酶 精确吸取浓缩酶液1.00ml于必定体积的容量瓶中,用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)稀释定容;c.固体酶或浓缩酶液均须按附录A要求,精确稀释至必定倍数,酶液浓度应控制在耗费0.05mol/L硫代硫酸钠规范溶液(A-B)之差在0.5~1.0ml范围内。必要时可先做准备实验。4.2.4.2 测定a.于甲、乙两支比色管中,别离参加10g/L果胶溶液5ml,在50±0.2℃水浴中预热5~10min;b.向甲管(空白)中加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)5ml;乙管(样品)中加稀释酶液1ml、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)4ml,马上摇匀,计时。在此温度下精确反响0.5h,当即取出,加热煮沸5min停止反响,冷却;c.取上述甲、乙管反响液各5ml放入碘量瓶中,精确参加1mol/L碳酸钠溶液1ml、0.1mol/L碘液5ml,摇匀,于暗处放置20min;d.取出,参加2mol/L硫酸溶液2ml,用0.05mol/L硫代硫酸钠规范溶液滴定至浅黄色,加淀粉指示液3滴,持续滴定至蓝色刚好消失为其结尾,记载甲管(空白)、 乙管(样品)反响液耗费硫代硫酸钠规范溶液的体积。一起作平行样品测定。4.2.5 实验成果的核算1g酶粉或1ml酶液在50℃、pH3.5的条件下,1h分化果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。10X=(A-B)×c×0.51×194.14×n×-----=(A-B)×c×n×396.05 .......(1)5×1×0.5式中X--样品的酶生机,u/g(u/ml);A--空白耗费硫代硫酸钠规范溶液的体积,ml;B--样品耗费硫代硫酸钠规范溶液的体积,ml;c--硫代硫酸钠规范溶液的浓度,mol/L;0.51--1毫摩尔硫代硫酸钠相当于0.51毫摩尔的游离半乳糖醛酸;194.14--半乳糖醛酸的毫摩尔质量,mg;n--酶液稀释倍数;10--反响液总体积,ml;5--滴守时取反响混合物的体积,ml;1--反响时参加稀释酶液的体积,ml;0.5--反响时间,h。所得成果应表明至整数。注:果胶暂定用Sigma公司产品为规范底物。若购不到,运用其他厂产品时, 有必要作对照实验。4.2.6 成果的答应差平行实验,滴守时耗费硫代硫酸钠规范溶液的体积(毫升)不得超越0.05ml。