万字长文讲清荧光定量PCR（最新版）

病理医师

Nothing的上一篇万字长文获得不少朋友收藏，但是说实话，知识有些过时，很多名词生硬无法理解，并且有部分缺失，但是发现那么多朋友都关注荧光定量PCR实验，我觉得有更新文章的使命感。大家看了这篇文章，以此为准。上一篇就让它留在春天里吧，我们继续一贯的传统，系统化的介绍荧光定量PCR。
准备好葛优躺，Nothing（微信号：NO1-lab）今天让你在浏览手机的同时就能学好qPCR。学不好就收藏下来，反复看。冰冻三尺非一日之寒，大楼也不是一天建成。
为讲透qPCR，我会持续更新本文，点关注追踪查看。
1.初阶认识


这个阶段，我们要明白一些概念和术语，避免自己在师兄面前错误的瞎哔哔，比如：

问：RT-PCR、qPCR、Real-time PCR、real-time RT-PCR有什么区别？

答：RT-PCR就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR），是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行 DNA扩增。
Real-time-PCR和 qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）是一码事，都是实时定量PCR，指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。

虽然Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和 Reverse transcription PCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）。

而real-time RT-PCR（RT-qPCR）， 就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从 RNA 反转录得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。实验室大多做的是RT-qPCR，即对RNA表达量上下调进行研究，所以在实验室大家说的qPCR其实就是指RT-qPCR，但是别忘记了，在临床应用上还有很多对DNA进行定量分析的，比如乙肝病毒HBV检测。

问：看了很多荧光定量PCR，为什么扩增片段要控制在80-300bp范围内？

答：每个基因序列长短不一，有的好几kb，有的几百bp，但是我们在设计引物的时候只需要要求产物长度80-300bp，太短或者太长都不适合做荧光定量PCR检测。产物片段太短，无法跟引物二聚体区分，引物二聚体的长度大概在30-40bp，小于80bp很难区分是引物二聚体还是产物。产物片段太长，超过300bp，容易致使扩增效率低下，不能有效的检测出该基因的量。

打个比方，你在数一间教室里面有多少个人 的时候，只需要数一下有几张嘴就可以了，在检测基因的时候也是一样的，只需要检测某个基因的某一段序列来代表整个序列即可。如果你为了想数多少个人，既要数多少张嘴也要数多少个鼻子、耳朵、眼镜，反而容易数错。

扩展一下，在生物学研究上，有很多以点带面的研究案例，因为任何一个物种的基因序列都很长，没必要也不可能对所有片段进行测定，比如细菌16S测序，就是对细菌的保守序列进行测定，以推断细菌某个种群的数量。

问：qPCR引物设计的最佳长度是多少？

答：一般来说，引物长度大概在20-24bp范围是比较好的。当然我们在设计引物的时候一定要注意引物的TM值，因为这个关系到最佳退火温度。经过大量的实验证明，60℃是一个比较好的TM值。退火温度太低容易导致非特异性扩增，退火温度太高一般会导致扩增效率比较低，扩增曲线起峰比较晚，CT值延后。

问：染料法和探针法有何不同？

答：染料法 一些荧光染料如SYBR Green Ⅰ，PicoGreen，BEBO等，它们本身不发光，但结合于双链DNA的小沟后会发出荧光。所以当PCR反应刚开始时机器并不能检测到荧光信号，当反应进行到退火-延伸阶段，此时双链打开，在DNA聚合酶的作用下新链合成，荧光分子就结合于dsDNA的小沟中并发出荧光，随着PCR循环数的增加越来越多的染料与双链DNA结合，荧光信号也不断的增强。染料法主要应用于科研。
PS：做实验小心点，染料可是要跟人的DNA结合的，小心变成荧光人。



染料法（左）探针法（右）

PS：做实验小心点，染料可是要跟人的DNA结合的，小心变成荧光人。



SYBR GreenⅠ与DNA小沟结合


探针法 Taqman探针是最为常用的一种水解探针，在探针的5’端存在一个荧光基团，通常为FAM，探针本身则为一段与目的基因互补的序列，在探针的3’端有一个荧光猝灭基团，根据荧光共振能量转移原理(Förster resonance energy transfer， FRET)，当报告荧光基团（供体荧光分子）和猝灭荧光基团（受体荧光分子）激发光谱重叠且距离很近时（7-10nm），供体分子的激发可以诱发受体分子发荧光，而自身荧光减弱。所以PCR反应开始，探针游离于体系中完整存在时，报告荧光基团并不会发出荧光，当退火时，引物和探针结合于模板，在延伸阶段，聚合酶不断的合成新链，由于DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，到达探针时，DNA聚合酶就会将探针从模板上水解下来，报告荧光基团和猝灭荧光基团分开，释放荧光信号。由于探针和模板存在一对一的关系，所以在试验的精度和灵敏度上，探针法都要优于染料法。探针法主要应用于诊断。

问：什么是绝对定量？什么是相对定量？

答：绝对定量是指通过qPCR计算出待测样本的初始拷贝数量，比如1ml血液里有多少个HBV病毒。相对定量得到的结果为特定样本中目的基因相对于另一参照样本的量的变化，基因表达量上调或者下调倍数。

问：RNA提取量、反转录效率、扩增效率会不会影响实验结果？
问：样本保存、提取试剂、反转录试剂、透光耗材会不会影响实验结果？
问：什么方法可以校正实验数据？

关于这些问题，我们在下文进阶和高阶里面会详细描述。
2.进阶认识


关于实时荧光定量PCR，我们必须认清这样一个现实，每年发表的成千上万的科研论文，其中利用到荧光定量PCR技术的不是小数目。

那如果没有一个共同的标准来衡量荧光定量PCR实验，结果可能千差万别，对同样的物种同样的基因，用同样的处理方式，检测出来的结果也是千差万别，后来者也难以重复出同样的结果，你上调我下调，孰对孰错，谁也不知道。

这是不是说荧光定量PCR就是一个骗子技术或者说是一个不靠谱的技术？并不是，就是因为荧光定量PCR比较敏感比较精确，一点错误的操作就会出现完全相反的结果。失之毫厘谬以千里。文章作者可能会被审稿人反复折磨，同时，杂志审稿人也被不同的实验结果难以取舍。

所有的一切，都指向荧光定量PCR实验没有达成共识。为此，行业资深科学家开始制定标准，要求投稿人在文章中提供一些必要的实验和数据处理的细节（包括必要的数据）来满足这些标准。

审稿人读到这些细节就可以判实验的质量；将来的读者也可以据此来重复试验或者改进实验。那么这样出来的实验结果就是充满了信息量、是高质量的，是可用的。

MIBBI（Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations - http://www.mibbi.org) 应运而生。MIBBI是一个为实验提供标准的项目，发表在nature上，这个项目针对各类生物学试验，包括细胞生物学、Microarray、我们现在要讨论的qPCR等等，给每一类实验规定了在提交稿件时是都应该提供那些信息。

MIBBI项目中，与荧光定量PCR相关的文章有两篇，分别是：

• RDML (Real-Time PCR Data Markup Language )——实时定量PCR数据的结构化语言和报告指南；
  
• MIQE（Minimum Information for      Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）——用于发表关于实时定量PCR实验文章的最小信息。
  

首先，我们说说RDML，也就是术语规范。

凡事如果没有标准定义，就无法继续讨论，这也是为什么名词解释在考试中如此重要的原因。
荧光定量PCR实验用到的术语包括以下内容，QIAGEN公司已经为我们做了最佳的总结，以下全是干货，建议学霸收藏不定期食用并消化。

扩增曲线
扩增曲线是指PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。


优秀的扩增曲线应有以下特点：基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势；曲线拐点清楚，指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高；扩增曲线整体平行性好，表明各管的扩增效率相近；低浓度样本扩增曲线指数期明显。

基线（Baseline）
基线是早期循环的噪点水平，通常在第3~15循环之间测量，这是因为在此期间还检测不到扩增产物引起的荧光值增加。用于计算基线的循环数量是可以改变的，如果使用高模板量或者靶标基因的表达水平高则循环数量需要减少。


设置基线需要查看线性度扩增曲线的荧光数据。设置基线，使得扩增曲线的增长所开始的循环圈数大于基线循环最高圈数。对每个靶标序列都需要单独设置基线。早期循环检测到的平均荧光值需要从扩增产物中获得的荧光值中减去。各种Real-Time PCR软件的最新版本允许单个样品自动优化基线设置。

在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，被称作基线，但是如果我们仔细观察一开始的几个循环，我们会发现基线范围内是下图的情况。



本底
本底是指反应中的非特异性荧光值。例如：低效率的荧光淬灭；或由于使用SYBR Green造成的大量双链DNA模板。信号的本底分量由Real-Time PCR软件算法数学除去。

报告基因信号
报告基因信号是指在Real-Time PCR过程中由SYBR Green或荧光标记的序列特异性探针产生的荧光信号。

归一化报告信号（RN）
RN指的是报告染料荧光强度除以在每个循环中测量的被动参照染料的荧光强度。

被动参比染料
在某些Real-Time PCR中，荧光染料ROX被用作荧光信号标准化内部参照。它可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。



荧光阈值（threshold）
阈值调整到本底值之上并显著低于扩增曲线的平稳值。它必须处于扩增曲线的线性区域内，代表了PCR检出的对数线性范围。阈值应在对数扩增曲线视图中进行设置，以使PCR的对数线性期易于识别。如果Real-Time PCR中有多个目标基因，阈值必须为每个目标进行设定。一般将 PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR前3~15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。一般来说，每台仪器在使用前都已经设置好了荧光阈值。

循环阈值(CT)或交叉点（CP）
扩增曲线穿过阈值的循环（即，荧光检测值显著增加的点）。CT可以是一个分数，并且可以计算起始模板量。CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

ΔCT值
ΔCT值描述了靶标基因和相应的内参基因CT值的差值，例如管家基因，并用于标准化模板的使用量：
⇒ ΔCT = CT (靶标基因) – CT (内源性参比基因)

ΔΔCT值
ΔΔCT值描述了感兴趣样品（例如，刺激细胞）的平均ΔΔCT值与参考样本（例如，未刺激细胞）的平均ΔΔCT值之间的差值。参照样品也被称为校准样品，并且所有其它样品进行相对定量时都将被标准化到如此：
⇒ ΔΔCT = 平均ΔCT (感兴趣样品) – 平均ΔCT (参比样本)

内源性参比基因（内参基因）
内源性参比基因的表达水平在样品间不存在差异，例如管家基因（看家基因）。对比内参基因与靶标基因的CT值可以将靶标基因的表达水平归一化到输入的RNA或cDNA的量（见上面关于ΔCT值部分）。

内参基因对以下情况作出校正：可能的RNA降解或RNA样品中存在酶抑制剂的情况，以及RNA含量、逆转录效率、核酸回收和样品处理的变动。为了选出最优的参照基因（多个），我们对算法进行了改进，允许其选择依赖于实验设置最优参照。

内参
在同一反应中被作为靶序列扩增，并用不同的探针（即，进行双重PCR）检测的对照序列。内参经常被用来排除失败的扩增，例如没有检测到目标序列的情况。
标定样品
在相对定量中使用的参比样品（例如，源自细胞株或组织纯化的RNA），用以与所有其他样品进行比较，以确定某一基因的相对表达水平。标定样品可以是任何样品，但通常是一个对照品（例如，未处理的样品或来自实验零时的样品）。

阳性对照
使用已知量模板的对照反应。阳性对照通常用来检查引物集或引物–探针集工作是否正常，以及反应是否正确设置。

无模板对照（NTC）
包含除模板之外的所有扩增反应所必要组分的对照反应，模板通常用水代替。使用NTC可以发现由于试剂污染或外源DNA造成的污染，从而确保检测数据的真实性和可靠性。如果NTC对照有扩增，即代表有污染。

无RT对照（NRT）
RNA提取过程中可能含有残留的基因组DNA，这个危害极大，是影响数据质量的罪魁祸首，是qPCR的天敌，所以在设计实验的时候一定要设计为仅能扩增RNA的检测。有两个办法，一是跨内含子设计引物，一是彻底去除DNA，孰优孰劣，下文再说。NTR对照就是检测DNA污染的照妖镜，如果有扩增，即代表有污染。

标准品
标准品是指已知浓度或拷贝数，用于构建标准曲线的样品。为保证标准品的稳定，一般将基因片段克隆到质粒后，作为标准品。

标准曲线
通常用标准品按照倍比稀释成至少5个浓度梯度，在CT值和拷贝数的坐标中描出5个点，连点成线，生成标准曲线。每个标准曲线，需要检查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之间，每个浓度一式三份，与其它点差异较大的点，应该舍弃。待测样本的CT值带入标准曲线中，可以计算出待测样本的表达量。


待测样本的CT值带入标准曲线中，可以计算出待测样本的初始拷贝数。


效率和斜率
标准曲线的斜率代表着real-time PCR的效率。

• 斜率 –3.322表示该PCR扩增效率为1，或效率100％，PCR产物的量在每个循环增加到两倍。
  
• 斜率小于–3.322（例如，–3.8）则表示PCR的效率<1。通常，大多数扩增反应因为实验的限制不能达到100％的效率。
  
• 斜率大于–3.322（例如，–3.0）表明PCR效率似乎是大于100％，这就很奇怪，一个PCR循环怎么可能产生多于二倍的扩增产物呢？这种情况出现在PCR反应的非线性期，即存在大量的非特异性扩增。
  

熔解曲线
qPCR扩增完成后，对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，当到达某一温度时（Tm），会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。不同PCR产物其Tm值也不同，熔解温度就不同，以此可以对PCR的特异性进行鉴定。


熔解曲线（求导曲线）
对熔解曲线求导，形成峰图，更直观的显示PCR产物片段的情况。由于熔解温度即是该DNA片段的Tm值，以此可以判断影响DNA片段Tm值的一些参数，比如片段大小、GC含量等等。一般来说，根据我们的引物设计原则，扩增产物长度在80-300bp范围，那么熔解温度应该是在80℃-90℃之间。


熔解曲线的解读：如果在80℃-90℃之间出现唯一主峰，说明荧光定量PCR完美；如果在80℃-90℃之间出现主峰，80℃以下出现杂峰，基本考虑引物二聚体，可尝试提高退火温度解决；如果在80℃-90℃之间出现主峰，温度上升又出现杂峰，基本上考虑有DNA污染，需要在实验初始阶段去除DNA。


当然还有些比较变态情况，下文会一一分解。
3.高阶认识


做qPCR不得不说MIQE，Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments——用于发表关于实时定量PCR实验文章的最小信息。为了简化大家的理解，我们将重点内容简化。

MIQE原文大家可以在网上搜索到，其中最重要的是其规定了发表文章的时候需要提供的数据核查清单。








审稿人读到这些细节就可以判实验的质量；将来的读者也可以据此来重复实验或者改进实验。
值得注意的是，在这个清单中，分别用E或D对每一条list的重要性进行标记，什么意思呢？E：essential information基本信息（必须提交）；D：desirable information理想的信息（尽可能提供）。

MIQE（1）—实验设计
很多学渣在读完研究生完成答辩，还不会独立设计一个实验，笔记本翻开，老师叫怎么做就怎么做。结果实验设计不严密，杂志编辑部说要补这个图那个图，就晕头转向的跟着做了。学渣都是这样炼成的！



言归正传，实验的首要原则，是要确定实验逻辑的严密性。最根本的是实验设计，而实验设计最重要的是如何设定目标样本、参考样本（对照）、重复数量，让实验数据具有参考性、可比性和说服力。

目标样本是指经过某种处理后需要我们检测目的基因的样本。参考样本即没有做任何处理的样本，生物学上常常说的野生型。

实验的重复(Experimental Replicates)非常重要，具有说服力的重复数量一般要达到三个以上，要区分什么是生物性重复、什么是技术重复。

生物性重复（Biological Replicates）：不同的材料（时间、植株、批次、反应板）做的同一验证实验。



生物性重复

我们以农药处理辣椒为例子，我们要对ABC三个植株进行农药喷洒，那么ABC三个植株就是三个生物性重复，它们就是不同的材料进行的同一验证实验。但是作为实验肯定是需要对照的，所以我们在操作的时候可以对A植株的其中一根枝条进行喷洒，形成A植株的实验组，对A植株的其他枝条不喷洒，形成对照组。对B和C也进行同样的处理。

技术重复（Technical Replicates）:是为了避免操作上导致的误差而设计的重复实验，实际上就是同一材料所包括的复孔。处理和对照都要有目的基因和内参基因的重复设置（最少三个）。



技术性重复

再拿农药处理辣椒作为例子，对于A植株实验组，我们分别对它的目的基因和内参基因做1、2、3三个PCR复孔，以待检测完以后取平均数，对于A植株的对照组也作同样处理。同样，对于B、C植株也作同样的处理。这就是技术性重复。

值得注意的是：进入统计的是生物性重复，而技术重复是检验实验过程中是否有任何随机现象，使实验结果可信，也就是为了我们经常说的取它们的平均数避免误差。

阴性对照—NTC与NRT
NTC（No-Template Control），没有模板的对照，用来验证实验材料是否具有污染。一般以水作为模板，如果有荧光反应，说明实验室有核酸污染发生。

这些污染来自于：水不纯，不合格的试剂含有内源DNA，引物污染，实验室器材污染，气溶胶污染等等，需要使用RNase清除剂和RNase抑制剂。气溶胶污染是最不容易发现的，想象一下你的实验室就像雾霾，空气中悬浮着各种核酸。


NRT (No-Reverse Transcriptase)，没有反转录的对照，是未经反转录的RNA作为阴性对照，这是对gDNA残留的控制。

在做基因表达时，通过检测反转录后的cDNA量来检测RNA的量，那么如果在提纯RNA时有gDNA的残留，就会造成实验结果的误差，因为实际得到的结果是gDNA和cDNA的总体水平而不仅仅是cDNA的，需要在提取RNA的时候彻底去除gDNA。

MIQE（2）—样本信息
所谓样本信息，就是说我们在发表关于qPCR的文章的时候，一定要讲明白样本信息，这是文章不可或缺的部分。同样，我们在处理样本的时候，也要同样规范自己的操作，以保证样本的有效性。


对样本的描述只是一个结果，而我们更应该注意的是整个实验过程中的取材。

实验材料的选择
血液样本——选择新鲜血液，不得超过4小时。细胞样本——选择处于生长旺盛的时期收集新鲜的细胞。动物组织——选择新鲜、生长旺盛的组织。植物组织——选择新鲜的幼嫩组织。


你一定注意到这几句话中都有一个关键词：新鲜，所以说小鲜肉并不是大妈才喜欢，实验室的师姐师妹都喜欢。因为他们不油腻。

实验材料的保存
一般来说，我们不建议对样本进行保存，如果条件允许的话。但是不乏有很多朋友无法在采样后立刻进行实验，有的甚至需要背着液氮罐到野外采样。

对于这种苦逼朋友，我只能说你不了解试剂耗材，现在很多试剂耗材公司生产出可以常温保存RNA样本的试剂，可以选择使用。常规的保存方法就是液氮保存，使用方便携带的小液氮罐。把样本带回实验室以后，保存在-80℃冰箱即可。据本人了解，液氮罐目前就两个品牌比较靠谱：金凤和海盛杰。有人说买个液氮罐真麻烦，那你是没使用科邦邦，一个网站啥都能搞定。


对于牵涉到RNA的实验，六字原则必须遵守：低温、无酶、快速。

低温这个概念容易理解；无酶，我们生活的世界到处都是RNase（要不然你早就被HIV搞死了），所以在做实验的时候如何避免RNase，是一种很重要的观念；快速，天下功夫无坚不破，唯快不破。所以，从某种意义上说，提取时间越短的试剂盒越好，为啥擎科生物的试剂盒要强调速度，因为他们深谙其道啊。

PS：有的女孩子做实验很仔细，但是做几年也不如一个灌篮高手做得好，觉得上天不公平，怨天尤人，寻死觅活，其实她没有明白，就是因为她太仔细做事情很慢，反而没有保护好RNA，而灌篮高手手脚灵便，做实验的时候还想着三下五除二搞定了灌篮去，反而把实验做好了。

注意：慢了，RNase入侵的机会就更多了。怎么训练自己快速呢？没有办法，多练习。

对于不同的实验不同的样本，还是要多看文献，选择合适的方式进行处理。对于样本的取材和保存过程，MIQE都要求必须清楚明白的写在论文中，以方便审稿人审阅论文的可靠性，同时也方便后来的愣头青们重复你的实验。

生物学实验虽然难但是高端，一不小心可以颠覆世界，比如搞个SARS变成生化危机，比如搞个杂交水稻拯救13亿人口。下图就是个化学实验，你们看看他那个屌丝样子就应该明白自己的研究有多么骄傲。算了，别黑他。



MIQE（3）—核酸提取。
核酸提取是一个大事，所有的分子生物学实验都是从核酸提取开始。首先，我们还是照抄一下MIQE关于核酸提取的内容。


看这个表格不能停留在表面，表格就是教条，要做学霸一定要多问个为什么。这个表格的本质内容是：追求RNA的纯度、完整性、一致性、提取量。

过程或仪器
第一个部分就是核酸提取的步骤，如果用核酸自动提取仪提取（高级哦，采购找我），需要注明仪器的型号名称。


试剂盒名称以及变动细节

用的什么试剂盒，加了什么特殊试剂或者做了什么特殊操作要讲明白，以便别人能够方便的重复出你的实验。

有的人在提取特殊样本的时候加了一些特殊试剂，认为这是自己的秘密武器不告诉别人，保密的同时，也失去了让你的文章大放光彩的机会。千万别耍小聪明，做科研要做到比乡下老张还老实，你想耍小聪明，文章就会让你出笨笨。

记住，你们在订购试剂盒以及写入文章的时候一定要记住试剂盒的产品编号，试剂盒上一般有两个编号：Cat—产品目录号（产品编号、货号），Lot—产品批号（用于标明产品出于哪个批次）。


另外订购生物化学类试剂的时候经常会用到CAS号，我就一起普及了，CAS号是美国化学会专门负责给予每一个新出的化学药品的编号，一般是三个数字用短杠连接。如水的CAS号：7732-18-5。化学药品常常会有多个别名，但是CAS号是唯一的。订购药品的时候可以先查查它的CAS号。


言归正传，为什么要清楚明白的描述这些，其实也是为了在RNA提取质量上把关，仪器和试剂盒的使用，会让RNA提取一致性更好。普通实验室提取规模不大，用用试剂盒就得了。

DNA酶或RNA酶处理的细节
荧光定量PCR很重要的问题是要防止DNA污染，有污染不实验。因此，必须要说明你用于处理DNA的过程，这是为了证明实验过程中的DNA保证已经得到完全彻底的去除。用一个示意图表示。



RNA与DNA示意图，切勿为真

一般来说，去除DNA的方法是提取RNA后用DNase处理。不过这都是比较老的方法了，商品化的RNA提取试剂盒，已经能够在提取过程中去除DNA。比如济凡生物的一系列试剂盒。

注意：提取RNA的过程中去除DNA是非常危险的双刃剑，这会使得提取RNA的操作时间延长，增加RNA降解的风险，基本上就是在RNA得率和纯度之间做取舍。

另外，在硅基质吸附柱上加入的DNase量非常小，必须要优质的DNase才能达到效果，未经优化的DNase是无法做到快速彻底消化的，这一点非常考验商家技术水平。当然，更有奇葩的商家吹嘘说不用DNase也能去除DNA，可以这么说，凡是吹牛说不用DNase就能彻底清除DNA的都是耍流氓。DNA是比较稳定的双链结构，不是羽扇纶巾谈笑间就能灰飞烟灭的。

污染评估
评估方法：电泳检测，1％琼脂糖，6V/cm，15min，上样1～3 ul   



核酸定量分析
通常使用紫外分光光度计进行测量 ，先给大家普及一下OD260、OD280、OD230三个值的含义。

• OD260nm：是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内。
  
• OD280nm：是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。
  
• OD230nm：是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。
  

接下来说各个指标的作用。对于A260来说，可以用来测定核酸的产量。当OD260=1时，dsDNA=50μg/ml，ssDNA=37μg/ml，RNA=40μg/ml。

对于纯度来说，就需要看那几个我们常见的比值了：OD260/280及OD260/230。

• 纯DNA：OD260/280约等于1.8，大于1.9时提示有RNA污染，小于1.6时提示有蛋白质及酚类污染。
  
• 纯RNA：1.7＜OD260/280＜2.0，小于1.7时提示有蛋白质及酚类污染，大于2.0时提示有异硫氰酸残留。
  
• OD260/230：不伦是DNA还是RNA,参考值都为2.5，小于2.0时提示有糖类、盐类、有机物的污染。
  

RNA完整性测量

RNA的完整性非常重要，一般需要做一个RNA变性胶实验，检验28S和18S RNA之间的亮度是不是二倍关系。当第三条带5S出现的时候，说明RNA已经开始降解了，无脊椎动物除外噢。


RNA质量评估的数据：除了以上检测，在RNA完整性方面，还有一些比较高级的仪器检测，比如Experion全自动电泳系统RQI完整性检测，可以检测出RNA是否隐形的被降解。

科研上做荧光定量PCR是目标基因和内参基因的比较，因此在RNA样本保存，RNA提取，等过程中，首要目标都是保证RNA的完整性。

RNA的完整性是如何影响目标基因和内参基因之间的平衡，可以从下图简单的理解。降解会导致基因残缺，无论是内参基因的残缺还是目标基因的残缺，对数据都是有极大的影响。



目标基因和参考基因示意图，切勿为真


抑制测试（高低浓度或其它情况下CT值是否受抑制）


以该图为例，五条曲线的Ct值分别如下。曲线之间CT值分布不均，高低浓度下Ct值均有延迟，这就是PCR受抑制的情况。


重点：在RNA提取过程中，我们需需要摒弃错误观念，树立正确观念。

错误的观念是：RNA提取只追求得率，认为获得的RNA量越大越好，实际上我们做定量的时候，如果基因数量不是很大，是要不了多少RNA的，你所提取的RNA量绰绰有余。

正确的观念是：RNA提取要追求纯度、完整性、一致性。纯度能够保证后续的反转录不受抑制以及能够保证不被DNA影响数据。完整性能够保证目标序列和内参的平衡。一致性能够保证上样量稳定。

MIQE（4）—反转录
错误观念：追求较高的上样量 。
正确观念：追求一致性（稳定性），不管RNA上样量如何，反转录的效率都保持一致，确保cDNA的差异能够真实反映 mRNA 的差异。
我们用一个示意图解释此过程：



反转录效率示意图，切勿为真

首先，我们要理解反转录过程与PCR过程的区别，PCR经过多次升温退火延伸的过程，目的片段呈指数增长；而反转录没有这个过程，我们可以想象反转录其实就是一对一的复制过程，有多少条RNA就得到多少条cDNA

常有学渣把反转录的结果拿去做电泳检测，奇怪为啥没有结果，基本上就是弥散的，如瀑布般，看不到任何有用信息，现在该明白了吧，因为大大小小的片段都被反转录了，无法集中在一个片段上。而且由于RNA的量比较少，所获得的cDNA量也比较少，不像PCR有放大效应，因此，基本上无法进行检测。



cDNA电泳结果

其次，理想情况下，反转录一对一进行，但是没有哪个公司的反转录酶能够达到这种效果，基本上大多数反转录酶的效率游走在30-50%之间。如果现实情况是这样的话，我们宁愿反转录效率能够比较稳定，也就是图中我们希望看到的部分：3条RNA得到2条cDNA，6条RNA得到4条cDNA，这样无论上样量多少，反转录效率都比较稳定。我们不希望看到反转录效率不稳定，高浓度被抑制的情况。

那么，如何验证反转录效率是否稳定呢？方法很简单，只需要做个对比试验：一是RNA进行倍比稀释后再反转录成cDNA，二是反转录成cDNA后再做倍比稀释，两者做qPCR，看看得到的斜率是否一致。作为学霸的你应该秒懂。如下图：



对RNA和cDNA倍比稀释，测试反转录效率是否稳定

反转录酶和试剂盒
完美的荧光定量PCR怎么少得了优秀的反转录酶以及试剂盒呢。反转录酶根据来源大体上分两种，AMV或者M-MLV，他们的性能跟表格中显示的是一样一样的。


RNase H活性
RNase H即Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。常用于cDNA第二链的合成。

这是一个奇怪的东西。我们说反转录酶有RNase H活性，并不是说反转录酶中含有RNase H，也可能无法从反转录酶中分离出RNase H，也许是反转录酶中某些基团的构象造成了该反转录酶有此活性存在。

所以，别看AMV反转录效率高一些，但是其RNase H活性使得cDNA的得率降低。当然，试剂厂商都在不断优化自己的产品，尽量消除反转录酶中的RNase H活性，提高cDNA的得率。
退火温度



不同温度下RNA的二级结构

不同温度下RNA的二级结构 看上图，用mFold在线工具，判断在特定温度和盐浓度条件下目标片段的二级结构。该RNA在55℃的情况下，二级结构还是非常复杂的，反转录酶无法工作，要到65℃才能完全解开二级结构，而AMV和M-MLV的最适温度都远远小于这个温度。
怎么办？二级结构是模板本身自己互补配对，导致引物和反转录酶与模板结合面临很强烈的竞争，导致结果E很低、重复性很差等一系列的问题。

怎么办？只有尽可能提高退火温度。

很多试剂厂家都在通过基因工程手段改良自己的反转录酶，有的提高反应温度，比如济凡、艾德莱，有的去除RNase H酶活性基团，提高酶和RNA模板的亲和力。高亲和力可以竞争性地挤开二级结构，顺利的通读下去，同时也大大地提高了反转录效率。
重点：反转录更重要的是在追求反转录效率的一致性（酶不仅要效率高还要稳定），而不是上样量，如果不是做特别大规模的荧光定量PCR，根本要不了那么多的cDNA。
各厂家在追求一致性的方面也做了些功夫，比如现在大部分公司都已经把反转录包装成为标准的试剂盒进行销售，这不失为一种很好的选择。

MIQE（5）—目的基因信息


上图解释
1. 这个基因对于重复实验是否有效，一般通过重复实验可以得到验证。
2. 基因ID，你懂的。
3. 基因长度，目的基因总长度肯定没有问题的，在设计引物的时候，还要确保扩增子的长度在80-200bp之间，以保证有比较好的扩增效率。
4. 序列Blast比对信息，目的基因需要在genebank做比对，以防止非特异性扩增的出现。
5. 是否存在假基因。假基因(pseudogene)与正常基因相似，但丧失正常功能的DNA序列，往往存在于真核生物的多基因家族中，常用ψ表示，是基因组中与编码基因序列非常相似的非功能性基因组 DNA 拷贝，一般情况都不被转录，且没有明确生理意义。
6. 引物相对于外显子和内含子的位置。早年，我们在解决DNA污染问题的时候，常常会关注引物和外显子、内含子的位置，一般考虑跨内含子设计引物，避免将DNA扩增出来。请看下图：黑色代表内含子，各种蓝色代表外显子，粉红代表普通引物，鲜红代表跨内含子引物。



示意图，切勿为真

这看起来是多么完美的计划，而实际上，跨内含子引物在多数情况下没有想象中那么大的魔力，同样会引起非特异性扩增。所以为了防止DNA污染的最佳方法还是彻底去除DNA。
7. 构象预测。再次使用这个例子，用 mFold 在线工具，判断在特定温度和盐浓度条件下，目标片段的二级结构。



不同温度下RNA的二级结构

二级结构是模板本身自己互补配对 ，它会导致引物与模板配对面临很强烈的竞争，引物结合的机会少了，结果E很低、重复性很差等一系列的问题出现。通过软件预测，如果没有二级结构的问题，那再好不过了，如果有，我们后续的文章会专门讨论如何解决这个问题。

MIQE（6）—qPCR 寡核苷酸


对于荧光定量PCR，你天天纠缠的第一件事是RNA提取，第二件事可能就是引物设计了。
首先，我们还是按照MIQE的核查清单来检验关于引物设计的规则，简单得让学渣们偷笑，一句话都可以讲完：搞清引物探针的序列和位置以及修饰方法。对于引物纯化方法，目前引物合成如此便宜，qPCR值得你进行PAGE及以上的纯化方式，而合成仪器这些信息并不重要，很多人做了几十年引物也不知道合成仪是ABI3900。
关于引物设计原则，大家大可不必死记硬背，因为大多数引物设计软件或者在线工具都能够兼顾这些问题（推荐在线工具primer3.ut.ee/），再说99.999%的引物设计都不是靠人工去看的，笔者有时候一天设计上百条引物，如果一条条看，那不得变成斗鸡眼了。
只需要在引物设计好以后，检查一下以下几点：
1. 靠近3’端设计引物：对于用oligo dT引物进行cDNA第一链合成的情况，考虑到反转录效率问题以及RNA完整性问题，设计引物需要靠近3’端设计，以提高扩增效率。用一个图解释如下（这都看不懂就没有办法了）：



为什么要靠近3’端设计引物，切勿为真

2. TM值：Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% 。
3. BLAST：为了避免对基因组的非特异性扩增，必须用Blast去做补充验证。

MIQE(7)—qPCR过程


1.qPCR试剂盒
按照MIQE要求，我们必须在文章中清楚的描述完整的反应条件，包括PCR的反应体系配置，用的什么试剂盒，制造商是谁，多大的反应体系，用的是染料法还是探针法，PCR程序设置。老司机一定会发现，只要选择好试剂盒，基本上以上信息就确定了。
目前，荧光定量PCR试剂盒的制造生产已经是一个非常成熟的技术，只要不是选择极偏极烂的厂商，出问题的概率不大，不过我们还是要跟大家普及几点：
热启动Taq酶：PCR最重要的部分是热启动Taq酶，市面上的热启动酶一般分为两种类型，一种是化学修饰的热启动酶（你可以想象成石蜡包埋），一种是抗体修饰的热启动酶（抗原抗体结合）。化学修饰是早期的热启动酶存在方式，达到一定的温度，酶就释放活性。抗体修饰的热启动酶是用生物学的办法封闭酶的活性，当到达一定温度，抗体作为蛋白就变性失活，酶的活性就发挥出来了。


然而，这个有什么用呢？是这样，抗体修饰的酶释放活性比化学修饰的酶释放活性要快，所以在灵敏度方面，抗体修饰的酶略占优势，以至于市面上的试剂盒基本上已经没有化学修饰的酶了。如果有，那么这个厂家还技术还停留在千禧年的时代。
镁离子浓度：镁离子浓度在PCR反应中至关重要，合适的镁离子浓度能够促进Taq酶活性释放，浓度过低，会显著降低酶活性；浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。镁离子浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。镁离子离子的浓度一般控制在25mM，当然了，一个好的试剂盒，镁离子浓度一定是控制的比较好的。有的商家在试剂里面加入镁离子的螯合剂，可以达到镁离子浓度自动调节的作用。
荧光染料浓度：荧光染料，也就是我们通常用的SYBR Green，该染料主要是靠结合在双联DNA的小沟中发生荧光，由于该染料对双链DNA的结合是非特异性的，也就是说只要是双链DNA与其结合，都能发生荧光，所以体系中的引物二聚体、DNA模板等都会与其结合，形成本底信号。
PS：由于其光敏的特性，市面上的产品一般都用棕色不透光的离心管包装（如下图）。不过，这样就会遇到一个问题，取样的时候是否吸到液体很难看到，这方面擎科的确是最人性化的（如下下图），用不透光的锡袋包装透明管，用完后装进锡袋，兼顾了避光和取样的方便性，大家一定要选对货号，TSE204是个超级性价比的存在，弄得我都想种个草。






荧光染料的浓度也很重要，浓度过低导扩增曲线后期上不去，不完美；浓度过高会造成噪点干扰。由于荧光定量PCR主要是看CT值，所以如果调不好荧光染料的浓度，低点比高点好。当然合适的染料浓度是最好的。


ROX：ROX染料是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。某些仪器厂家需要校正，某些不需要。例如使用Thermo Fisher Scientific公司的Real Time PCR扩增仪通常就需要校正，包括7300、7500、7500Fast、StepOnePlus等。一般试剂盒说明书都会有所描述。
弱氢键处理：弱氢键的处理是一个比较有技术含量的事情，Nothing翻看了很多试剂盒的说明书，都没有提到过这个话题，其实它是那么的重要。碱基的结合主要靠氢键的力量，强氢键就是正常扩增，弱氢键导致非特异性扩增，如果不能很好的消除弱氢键，非特异性扩增就无法避免。在笔者目及范围内，只有少数几家公司注意到这个问题。各位在购买试剂盒的时候可以对照参考你要选择试剂盒是否在这方面考虑过解决方案。


反应体积：20-50ul体系是比较常用的，更小的体积容易造成误差，一般来说，试剂盒的说明书会有推荐使用PCR反应体积，大家切勿自作聪明，用更小的体积以达到节省成本的目的。商家推荐使用体积，其实是经过测试的，也可能就是他们无法解决小体积造成误差这个问题。
2.管子板子的制造商和货号
荧光定量PCR的原理大家都知道，荧光收集主要是通过PCR管盖进行的，选择PCR耗材注意两点：透光性好，适配仪器。一般来说主流品牌的板子和管子都没问题，但是在适配方面得谨慎选择，要不然会上不了仪器。


4.顶阶认识


MIQE（8）—qPCR验证
这是是qPCR的重中之重！多少英雄好汉都在这里折戟沉沙，当然也有可能你运气比较好，研究的基因也简单，所以顺着风飘过了冰窟窿。qPCR的验证信息意在检验数据的可靠性，我们把必要的验证信息罗列如下：


1.特异性检验
通过检测电泳图片是否是单一条带；测序验证；熔解曲线看峰图是否单一；酶切验证等方法，检验目的基因扩增的特异性。
在此，我们着重介绍用熔解曲线的方法分析非特异性扩增的问题，一般来说由于我们引物设计的时候要求产物片段大小在80-200bp这个范围，这使得PCR产物的熔解温度在80-85℃的范围。所以如果有杂峰的情况肯定是有其他非特异性扩增产物出现；如果波峰出现在80℃以下，一般考虑是引物二聚体；如果波峰出现在85℃以上，一般考虑是有DNA污染或者更大片段的非特异性扩增。
注意：有时候只有一个80℃的单峰，这时候一定要坚持这个理念，很可能该扩增结果全部是引物二聚体。



正常的熔解曲线（单一峰无非特异性扩增）



有问题的熔解曲线（杂峰有非特异性扩增）

【案例分析】



有主峰，但是引物二聚体严重

下图这个单峰的溶解曲线很容易欺骗你的眼睛，认为是很完美的实验，结果完全错了，这时候我们得看溶解温度，波峰温度在80℃以下，完全是引物二聚体。



无目标片段，全是引物二聚体

在此，哥哥有点欲罢不能了，下图是一个学渣发给我的用手机拍的照片，他使用的试剂都是业界常用的品牌，从一个T字头品牌更换为另外一个T字头品牌，我想你们已经猜出来了。学渣向我哭诉：“第一个图片使用的试剂太好了，波峰单一，后来使用你推荐的试剂以后，变成第二个图的样子，出现了杂峰。你把我坑惨了。”
把两个图分开，咋一看，一个波峰单一，一个双峰，废话，单一峰当然好啦。真是这样吗？
比窦娥还冤，如果我把两个图摆成下图的样子，你立刻就明白了。事实上，我们很容易被这种图片麻痹，仔细分析后发现：第一个图波峰处于75℃，完全是引物二聚体；第二个图波峰分别出现在75℃和82℃，至少还有产物出现。



学渣反馈的图片

所以根本的问题不是试剂问题，而是引物设计的问题，同时也证实了某些大牌并不是铁打的质量，也应证了哥哥之前说的那句话：不是试剂品牌撑起了你的文章，而是你的文章撑起了试剂品牌。试想，如果这个学渣没有更换试剂，这个错误的数据就这样拿到水刊去，等来的也是悲剧。
2.空白对照的Ct值
不解释，如果空白对照有Ct值，不就是污染了吗？不过你还需要明白，是哪个空白对照有Ct值，如果是NTC，说明是试剂污染等外源DNA，如果是NRT，说明是提取的RNA有DNA污染。
3.标准曲线
包括斜率和计算公式，通过公式可以计算PCR效率，一个完美的实验，要求标准曲线的斜率slope趋近于3.32，R² 趋近于0.9999。
4.线性动态范围
反应的动态范围是线性的，根据生成标准曲线的模板，动态范围应当包括至少5个浓度梯度，并且注意高浓度梯度和低浓度梯度下Ct值的变化。
5.检测精度
qPCR结果变化，也就是重复性不好，也即精度差的问题，是由很多因素导致的，包括温度、浓度、操作等都会影响。qPCR精度的一般随着拷贝数减少而变得更不可控。理想的状态是实验内变化，这种技术上的变化应该有别于生物变异，生物重复可直接解决不同组或治疗组之间的qPCR结果的统计学差异。特别是诊断分析，必须报道不同部位和不同操作者之最批间精度(重复性)。
6.检测效率和LOD（多重qPCR中）
LOD为检测到阳性样本最低浓度为95%。换句话说，包含一组靶基因复制内LOD的浓度最多不超过5%失败反应。在做多重qPCR分析时，特别是就应用于同时检测点突变或多态性检测，多重qPCR需要提供证据表明多个目标片段的准确度在同一管中不受损，多重检测和单管检测的效率和LOD应该是相同的。特别是高浓度靶基因和低浓度靶基因同时扩增时，必须注意这个问题。
问题和解决方案一般来说qPCR调试经常遇到的问题集中在以下几个方面：

• 出现非特异性扩增
  
• 引物浓度难以选择和引物二聚体的困扰
  
• 退火温度把握不准
  
• 二级结构影响扩增效率
  

非特异性扩增
出现非特异性扩增，一般想到引物设计是不是不太合适，但是在不急着更换引物的情况下，可以先试试以下办法（原理也附上）：

• 提高退火温度——尽量让弱氢键无法维持；
  
• 缩短退火、延伸时间——减少弱氢键的结合机会；
  
• 降低引物浓度——降低多余引物和非目标区域的结合机会；
  

扩增效率低
与非特异性扩增相反的情况——扩增效率低，应对扩增效率低的措施也刚好相反：

• 延长退火、延伸时间；
  
• 改为三步PCR，降低退火温度；
  
• 提高引物浓度；
  

Ps：很多90后研究生都不愿意再去研究如何调试实验，希望试剂盒就能够完全解决问题（如果毕业后想去试剂公司做研发的另说），实际上试剂厂商也是这样思考的，希望傻瓜拿到都会用，所以试剂厂商在解决非特异性扩增的问题上花了不少功夫，包括引入弱H键吸收因子。要想轻松解决问题，傻瓜们还是要会看试剂公司的介绍，有没有吸收弱氢键的因子。
引物浓度难以选择和引物二聚体的困扰
法门1：一般来说qPCR的试剂盒说明书是有推荐体系和推荐引物浓度的。
法门2：通过设置引物浓度梯度的方法进行调试。下面盗用某公司图片来做个说明，下图是用三个引物浓度梯度（100nM、250nM、500nM）和四个模板浓度梯度（0.1ng、1ng、10ng、100ng）做出来的荧光定量结果，根据实验结果的Ct值作图如下：


引物浓度选择把每个引物浓度连成一条线如下：


引物浓度选择很明显，100nM、250nM的引物浓度线性关系比较好，500nM的引物浓度线性关系比较差。而100nM、250nM中，250nM的Ct值比较小，所以最佳引物浓度是250nM。一般来说严重的引物二聚体在熔解曲线可以看到。如果设计的引物避免不了引物二聚体怎么办？
法门3：减少引物用量，升高退火温度（不用解释）。
退火温度的经验值是60℃。如果把握不准，怎么筛选比较合适的退火温度呢？答案跟引物浓度的选择是一样的——梯度测试。拿个Bio-rad公司的图来说明问题，对某一个目的片段的扩增，设置八个温度梯度，每个做三个重复，得到的扩增曲线如下：




退火温度选择解读：

• 70℃、69℃——基本上引物都无法结合，所以没有扩增。
  
• 67.3℃——开始有少量扩增，Ct值比较大。
  
• 64.5℃——Ct值减小。
  
• 60.7℃、58.0℃、56.2℃、55.0℃这几个温度下Ct值基本上趋于稳定，只是最后的荧光值有区别。
  

又该如何选择呢？原则：Ct值靠前是第一原则，同样的Ct值选择较高的退火温度，以避免二聚体和非特异性扩增。55℃虽然有较高的荧光值，但是里面可能会有二聚体或者非特异性扩增。
但是聪明如你一定会思考：按理说，如果PCR反应特异性很强，引物浓度只要超过最低要求，高点低点应该没啥影响才对，就像荧光染料、dNTP一样。事实的确如此，只要退火温度优化的合适，引物浓度对Ct值的影响自然会降到最低。



退火温度优化得合适，引物浓度对CT的影响会降到最低

二级结构影响扩增效率
再拿Bio-rad公司的图片来说明问题，同样是设计温度梯度来扩增一个含有二级结构的基因。





二级结构出现

可以看出，随着温度梯度的下降，开始有产物出现并且Ct值往前靠，在60.7℃达到最小值，之后随着温度梯度下降，Ct值变大。反过来说，随着温度提高，二级结构打开，扩增效率上升，当到达一定温度后，再升高温度也无法提高扩增效率。因为这个时候引物都无法稳定结合了。所以，寻找Ct值最低的温度，这个温度就是扩增二级结构模板的最佳温度！ 当然聪明的傻瓜们一定知道，非必须的情况下，最好更换引物，避开二级结构区域。
5、应用层面

MIQE—数据分析


数据分析主要是由荧光定量PCR仪器已经给出，在之前的文章中其实做了很多数据分析层面的工作，比如空白对照，在设计实验的时候已经讲解，内参基因、重复数等等都已经阐明，此处我们主要讲解qPCR的应用。
qPCR应用广泛，实验验证、核酸诊断是最常用的场景。
绝对定量
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。



绝对定量的计算方法

绝对定量必须依耐标准曲线，要做标准曲线就需要标准品，通常标准品是用目标基因经过克隆后得到的质粒，为什么是质粒呢？因为环状的质粒DNA最稳定啊。将标准品按照倍比稀释（10倍稀释）5～6个梯度，注意稀释的时候一定要均匀。要让Ct值落在15-30之间。



标准品制备

同时，对待测样本也进行相应稀释（记住稀释倍数），Ct值也要落在15-30之间。标准品+待测样本一起上机。跑完后标准品制作标准曲线，待测样本带入标准曲线计算出浓度。
乙肝病毒HBV定量就是典型的绝对定量，可计算出1ml血液里面的病毒拷贝数。
拷贝数的计算
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×50ug/ml×稀释倍数
样本分子量=碱基数×324
待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014



拷贝数的计算方法






以上就是决定定量的计算方法，这是一个初中毕业就能搞定的数学问题，而数学问题一般交给计算机解决，如果有不懂的，可以来交流。
相对定量
相对定量主要应用于科研。1ml血液里面有多少个病毒，而且是DNA病毒，这是一个比较确定性的事件：血液的量可以确定，DNA病毒又比较稳定。但是我们很难去比较一张叶片里面的某个基因有多少个转录拷贝，因为叶片大小、重量、老嫩，都很难确定，提取RNA的多少难确定，反转录效率咋样也难确定，也就是说任何一个步骤都可能会让实验数据存在BUG，没法用。
所以相对定量一定要引入一个元素：内参基因。
也就是说，相对定量其实是目标基因和内参基因进行比较，在同一个组织，同一个细胞中比较，样本量、RNA提取量、反转录效率、PCR效率的影响比较小。因为样本量少，内参基因和目标基因都相对减少。这也是为什么我们之前一直强调均一性和稳定性的原因。
内参基因一般是管家基因（持家基因 house-keeping genes），就是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。
这个概念不要混淆，管家基因是生物功能名词，而内参基因是实验技术名词。管家基因需要通过验证才能被选为内参基因。
比如我们选择下图中几个管家基因，测试其在不同组织细胞中的表达量，发现β-2-microglobulin的表达量与其它三个基因迥异，不能作为内参基因。


了解内参基因的校正功能以后，由于内参基因的引入，这就衍生出两种算法。

• 双标准曲线法
  
• 2 -△△Ct法 (CT值比较法)
  

如果你是为了研究感兴趣的物种和基因功能，请放弃对算法的研究，直接利用公式即可，或者直接利用机器即可；如果你是数学理工直男，请自便。
双标准曲线法
通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。
优点：分析简单，实验优化相对简单
缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线
应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
公式如下：


举例如下：



根据定量结果计算出相对量

2 -△△Ct法 (CT值比较法)


优点：无需作标准曲线
缺点：假定扩增效率接近 100 %； 标准差< 5％，假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂。
应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一


当然，扩增效率通常不可能完美为1，修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于1，那么2－△△Ct可以修正为：（1＋E）－△△Ct，例如扩增效率为0.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct

至此，关于荧光定量PCR的内容已经终结。如果想继续了解，或者还没有搞懂的，可以联系Nothing，微信二维码传送。





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