如何评价液体活检在早期肺癌检测中的应用？

幸福侠侣

原文：ASCO2018回顾：液体活检在早期肺癌检测中的应用众所周知，早期治疗癌症可显著提高总生存率，但早期检测手段显然还不够成熟。在周一的2018 ASCO会议上，美国Dana–Farber癌症研究所的研究人员报告了其正在进行的循环无细胞基因组图谱( CCGA )研究的结果，表明分析血液中游离DNA的液体活检技术可以检测出早期肺癌。




原文地址：https://www.zhihu.com/question/280034472

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广东省人民医院吴一龙教授团队和吉因加合作开展的大型肺癌MRD前瞻性研究成果“Longitudinal Undetectable Molecular Residual Disease Defines Potentially Cured Population in Localized Non–Small Cell Lung Cancer”[1]，荣登国际顶级期刊Cancer Discovery杂志（IF：39.397）,该研究结果的公布再次让“MRD在肺癌术后治疗中应用”成为热议话题。今天我们就看看该文章的主要内容：
介绍
为了提高局部非小细胞肺癌（NSCLC）根治性切除术后的治愈率，近几十年来不断努力改进辅助治疗模式。 常规辅助化疗和放疗是主要方法，但生存获益有限。令人鼓舞的是，如ADAURA 和 IMpower 010 试验所报告的那样，自从引入EGFR TKI和免疫检查点抑制剂 (ICI) 以来，已经取得了重大进展。 然而，简单的一刀切策略和长期的治疗期会导致不必要的毒副作用和相当大一部分患者的心理负担。 因此，在这种情况下，准确预测患者的疾病复发风险是一项关键挑战。
最近，已经开发了几种技术用于检测 NSCLC 中的分子残留病灶 (MRD)，主要是通过跟踪游离 DNA (cfDNA) 中的超低频体细胞肿瘤突变。现在人们普遍认识到，可检测到 MRD 的患者比未检测到 MRD 的患者预后更差。然而，仍有几个重要问题有待回答。首先，目前更多的注意力集中在阳性 MRD 信号上，这意味着癌症持续存在或疾病进展。然而，理论上，MRD阴性信号也具有重要的临床意义。因此，纵向检测不到 MRD 患者的长期临床结果是什么？第二，MRD在NSCLC辅助治疗中的预测作用有多大？第三，nonshedding tumor的存在在多大程度上影响 NSCLC 的 MRD 监测？最后，MRD 在 NSCLC 中应用的潜在局限性是什么，还有哪些障碍需要克服？因此，开展了这项前瞻性、非介入性、观察性研究，以阐明 MRD 监测在 I 至 IIIA 期 NSCLC 患者明确手术切除后的作用。
研究结果：
1.基线特征
从 261 名 I 至 III 期 NSCLC 患者中成功分析了 261 份术前血样、256 份肿瘤组织和 652 份术后血样。 所有患者均患有经手术病理证实的腺癌 (n = 203, 77.8%)、鳞状细胞癌 (n = 33, 12.6%) 或其他 (n = 25, 9.6%)，其中 104 名患者 (39.8%) 为 IA 期 59 名患者（22.6%）为 IB 期，53 名患者（20.3%）为 II 期，45 名患者（17.2%）为 III 期。 患者的中位年龄为 62岁（范围:27-84），37.2%（n = 97）的患者有吸烟史。 66例（25.3%）患者接受了围手术期治疗，其中化疗占40.9%（n=27），靶向治疗占45.5%（n=30），ICIs或ICI联合化疗占13.6%



左：261名患者基线特征；右:每个临床问题亚组分析患者流程图

Q1:Nonshedding tumor的存在
考虑到肿瘤的存在，手术前的ctDNA检测可用于评估每个个体的肿瘤 DNA 脱落情况。所有入组患者均成功进行了术前 ctDNA 检测；然而，其中只有 36.4% (n = 95) 为阳性，术前 ctDNA 阳性率在 IA 期为 21.2%，在 IB 期为 32.2%，在 II 期为 60.4%，在 III 期病例中为 48.9%。通过多变量分析，只有 SUVmax 和病理类型与ctDNA的存在相关（Fig1）。虽然术前检出率低下可能与上述因素对肿瘤 DNA 脱落能力的影响有关，但也可能归因于检测的灵敏度不足。为了进一步阐明检测性能和肿瘤的不脱落，研究将 ctDNA 结果与来自另外 11 名 I 期疾病患者的外周血和残余血液（术中立即通过切除肺叶的肺静脉残端在Streck管中采集5至10mL血液）的结果进行了比较，两项 ctDNA 检测均显示 100% 的一致性（Fig2）。这表明确实存在对低频突变的敏感性不足。这意味着一定程度的肿瘤不脱落。



Fig1



Fig2

Q2:无法检测到的 MRD 定义了潜在治愈的人群(PPV, NPV)
先来看下ctDNA采集的时间点（Fig3）：
Preoperation: 术前血样采集至手术前 3 天;
Landmark: 对于未接受辅助治疗的患者，标志性时间点（landmark time point）定义为术后 1 个月（±7 天）;对于接受辅助化疗的患者，辅助治疗前，标志性时间点（landmark time point）定义为最后一个化疗周期后1个月（±7天）; 对于接受辅助长期EGFR TKI或 ICI 的患者，标志性时间点（landmark time point）定义为手术后和辅助治疗前1个月（±14 天）; 辅助前时间点（preadjuvant time point）定义为术后至少1周;
Longitudinal: 纵向时间点(Longitudinal time points)定义为自landmark检测后每 3 至6 个月;
Surveillance: 监测时间点(surveillance time point)定义为临床复发后6个月内。由于影像学随访和血样采集是在同一时期前瞻性进行的，因此监测时间点可能是临床复发的同一天。



Fig3

截至 2021 年 12 月 31 日，共有 652 例术后血样成功检测 MRD（平均每位患者 2.5 次, 范围1-6次),中位随访时间19.7m。因随访时间不足部分患者被排除，最终根据预定义时间点分析，标志性时间点 n=245，纵向时间点 n=588，监测时间点n=44。
在标志性时间点分析中，224 名患者 (91.4%)  MRD 未检测到；其中Ⅰ期占65.6%，Ⅱ期占18.8%，Ⅲ期占15.6%，其中大部分（n=194）保持无病状态，阴性预测值（NPV）为86.6%。相反，在可检测到标志性 MRD 的 21 例患者中，17 例复发，阳性预测值（PPV）为 81.0%。此外，当整合纵向时间点时，NPV 和 PPV 分别进一步增加到 96.8% 和 89.1%（Fig4-A）。换言之，96.8% 的纵向未检测到 MRD 的患者在最后一次随访时仍然无病（其中 70.1% 处于 I 期，17.4% 处于 II 期，12.5% 处于 III 期）。纵向MRD检测的NPV在不同分期保持极高水平：I期为98.5%；II期为88.9%；III期为 100%（Fig4-B）。因此，在标志性时间点或纵向时间点未检测到 MRD 的患者比可检测到 MRD 的患者具有更好的DFS (Fig4-C and D)。值得注意的是，与具有标志性时间点检测相比，纵向未检测到的MRD患者的生存曲线接近完美，与治愈人群理想对应；并且不受临床分期的影响（Fig4-E）。 87.2% 的患者在影像学进展之前检测到 MRD，中位时间为 3.4 个月（Fig4-F）。
为了进一步阐明 MRD 监测过程中的时间动态模式，分析疾病复发风险较高的 II/III 期患者的 MRD 或复发事件的发生时间（Fig4-G）。可以看出检测到 MRD 的高峰时间范围是术后 12 至 18 个月（n = 8/18，44.4%）。在这 85 名患者中，可检测到的 MRD 或疾病复发的风险率曲线在 18 个月时达到峰值。因此，当患者维持未检测到的 MRD 超过 18 个月时，发生可检测到的 MRD 或复发的风险逐步降低（Fig4-H）。



Fig4

Q3:敏感性
截至2021年12月31日，47名患者（18.0%）确认复发。 从标志性时间点开始，灵敏度为 36.2%（95%CI，21.9%–50.4%）； 整合纵向时间点将灵敏度提高到87.2%（95%CI，77.3%–97.1%）。监测时间点的敏感性为 86.4%（95% CI，75.8%–96.9%）。
每个复发患者的围手术期治疗、手术和连续采血的时间和接受情况如Fig6。 值得注意的是，其中 6 人 (12.8%) 在整个随访期间检测不到 MRD。 无法检测到的 MRD 与复发部位显着相关，因为其中四个只有转移性脑疾病。 仅脑转移患者的总体敏感性为 20%。



Fig5



Fig6

Q4:辅助治疗的预测价值
共有55 名患者接受了辅助治疗，包括化疗 (n = 23)、靶向治疗 (n = 26) 以及联合或不联合化疗的 ICI (n = 6)。所有这些患者在手术后和辅助治疗前都有额外的 MRD 时间点（辅助前时间点），其中 10 人可检测到 MRD（18.2%）。我们进一步将这 10 名患者与其他在标志性时间点可检测到MRD 的患者进行了比较。发现辅助治疗可为可检测到 MRD 的患者带来生存获益（Fig7A and B）。然而，由于样本量有限，这一观察是初步的。相反，45 名患者在辅助前时间点检测不到 MRD。我们还将这些患者与其他标志性时间点不可检测的 MRD 患者进行了比较，发现辅助治疗不能改善 DFS（Fig7C）。在倾向评分匹配以平衡基线变量后，两组之间进一步证实了类似的结果（FigD and E）。这意味着无法检测到 MRD 的患者的肿瘤负荷极低，这些患者可能不需要辅助治疗。
进一步分析接受辅助治疗的 10 名可检测到 MRD 的患者 ctDNA 频率的动态变化。 其中 5 人未达到 ctDNA 清除（未清除组），其中 2 人经历了暂时性 ctDNA 清除但随后测试 ctDNA 阳性（清除然后升高组），其中 3 人保持 ctDNA 清除（清除组）。 清除组的患者实现了最长的 DFS，而其他两组的患者在 DFS 方面似乎没有差异（Fig7F）。 因此，可能表明在单个时间点清除的 ctDNA 不能完全反映辅助治疗的疗效。



Fig7

讨论
这项前瞻性研究代表了 NSCLC 中 ctDNA-MRD 检测的最大样本量，证明了 MRD 与临床结果之间的极好相关性。 特别是，那些纵向检测不到 MRD 的人可能代表潜在治愈的人群。 其次，本研究具体描述了 ctDNA 在 NSCLC 中的非脱落脆弱性。 第三，我们初步探讨了 MRD 对辅助治疗的预测价值，这表明辅助治疗对于未检测到 MRD 的患者没有必要。
总体而言，总体人群中术前 ctDNA 的检出率为 36.4%，相对低于已发表的研究报告[2]。必须考虑几个方面。首先，在本研究中，62.5% 的入组患者患有 I 期疾病。术前 ctDNA 阳性率在 IA 期为 21.2%，IB 期为 32.2%，II 期为 60.4%，III 期为 48.9%。然而，这些病例中的最大 VAF 与肿瘤 - 淋巴结 - 转移无关。其次，在 I 期 NSCLC 患者的独立队列中，其中 6 人（54.4%）在切除的肺叶残留血液中没有发现阳性 ctDNA 信号。这意味着一定程度的肿瘤不脱落。更重要的是，术前血液中检测不到的 ctDNA 似乎不会影响其监测疾病复发的实用性。在总共 41 例纵向可检测到 MRD 的复发患者中，14 例 (34.1%) 的术前 ctDNA 检测呈阴性。相比之下，所有未检测到 MRD 的复发患者在手术前均显示阳性 ctDNA 检测（6/6, 100%）。
MRD 在肺癌中具有极好的预后价值，尽管以前的研究包括样本量不足。值得注意的是，在这些研究中，75% 到 90% 的纵向检测不到 MRD 的患者保持无病状态，这表明他们可能已经治愈。识别和避免对这一潜在治愈人群的过度治疗是一个重要的临床问题。因此，在本研究中强调了 MRD 检测的 NPV。纵向检测不到 MRD 的患者可以保持极高的无病率（96.8%），这理想地定义了潜在治愈的患者群体。更重要的是，MRD监测的动态变化表明，可检测到的MRD发生的高峰时间段是在手术后12至18个月。因此，超过 18 个月纵向未检测到 MRD 的患者可能代表治愈人群。接下来的问题是：对于可检测和不可检测的 MRD 患者，辅助治疗的效果如何？换言之，能否指导未检测到 MRD 的患者避免辅助治疗？在一项 III 期随机试验 (IMvigor010) 中，将阿替利珠单抗辅助治疗与尿路上皮癌手术切除后观察进行比较，只有可检测到 MRD 的患者才能从阿替利珠单抗辅助治疗中获益（DFS，HR = 0.58；95% CI , 0.43–0.79)[3]。在本研究中，接受围手术期治疗的 IB 至 III 期 NSCLC 患者比例为 42.0%（IB 期为 13.6%，II 期为 49.1%，III 期为 71.1%），这与之前的研究相似[4]。探索性分析似乎反映了 MRD 在辅助治疗中的潜在预测价值。然而，由于样本量有限和基线特征略有不平衡，很难根据可检测 MRD 的亚组得出可靠的结论。尽管如此，我们确实观察到在倾向评分匹配后对 MRD 未检测到的患者进行辅助治疗的重要性。需要进一步的前瞻性临床试验来确认 MRD 的预测价值。
MRD 监测的敏感性在仅脑复发的患者中是有限的。 在总共五名仅脑转移的患者中，只有一名患者可检测到 MRD（n = 1/5, 20%）。 Garcia-Murillas 及其同事在乳腺癌研究中也观察到了类似的结果。 ctDNA 不太常检测到仅脑转移（n = 1/6, 17%）。 因此，克服 MRD 监测的血脑屏障值得进一步研究。 由于脑脊液 (CSF) 已被证明是一种与外周血相当或优于外周血的检测介质，用于检测中枢神经系统原发性或转移性肿瘤，因此对 CSF 进行高深度 ctDNA 检测可能是值得的，例如尿液中的 CAPP-seq 技术（uCAPP-seq）[5]，可以准确监测膀胱癌患者在根治性治疗后的复发性疾病。
值得注意的是，在匹配的肿瘤组织中 24% 的术前 cfDNA 突变和 25.4% 的术后 cfDNA 突变未发现。从这些独特的 cfDNA 变体中排除假阳性具有挑战性，认为这些突变主要来源于肿瘤。在的生物信息学过滤器管道中，来自白细胞的匹配基因组 DNA 和公共或内部数据库中变体的频率是两个重要的控制参考。大多数突变在癌症体细胞突变目录（COSMIC）和癌症基因组图谱（TCGA）的数据库中被报告为驱动基因或癌症相关基因。正如之前的研究中所报道的，它们都与克隆造血相关基因（即 DNMT3A、TET2 和 PPM1D）无关。另一方面，ctDNA 被认为反映了系统性突变谱。其他研究也报道了从 ctDNA 中检测到比肿瘤组织更多独特突变的事实。此外，组织局部采样本身不能代表肿瘤的全貌，因为肿瘤内的异质性也可能导致不一致[6]。
本研究存在一定的局限性。 首先，随访时间相对较短（中位随访时间为 19.7 个月）。 在我们的研究中，这仅导致 47 例复发。 其次，MRD 随访未严格在标志检测后每 3 至 6 个月进行一次。 然而，本研究以足够的统计功效证实了 MRD 的预后价值。
总之，在这项前瞻性研究中，证实基于 ctDNA 的 MRD 检测对 NSCLC 患者根治性切除术后的预后价值。 强调了未检测到MRD 的价值，它可用于定义局部 NSCLC 中潜在治愈的人群。 此外，亚组分析表明，对于未检测到 MRD 的患者，可能不需要辅助治疗。 发现仅脑部复发的病例是 NSCLC 中 MRD 监测的主要未解决挑战。

大力水手

1.什么是肺癌液体活检？
目前肺癌的液体活检主要是采用体液检测循环肿瘤细胞以及循环核酸物质，并检测有无基因突变
2.液体活检怎么操作？
液体活检一般采用患者的尿液或血液，进行检测
3.液体活检适合哪些患者？
肺癌病灶组织无法获得，患者一般情况差，无法获取组织病灶，初始靶向治疗后耐药的患者。
4.液体活检的阳性率？
液体活检的阳性率跟组织活检相比，阳性率偏低，据报道，只有40%-50%左右。
5.初次诊断，为什么需要慎重选择液体活检？
如果是初始诊断，组织活检是优先的，只要有足够的组织样本，就应该去做组织活检。如果组织不足量，补充液体活检就是合理的选择。很多患者并不明白这些道理，在外院做了液体活检，没有发现基因突变，就认为自己失去靶向治疗的机会。实际上，有些患者，再改成组织活检，就能够找到基因突变。因此，在初始诊断时，推荐先考虑组织活检，进行基因检测，组织标本无法取得的情况下，再考虑液体活检。
6.磨玻璃结节能否选择液体活检？
磨玻璃结节经常穿刺拿不到病理，可以考虑选择液体活检，但阳性率不高。
肺癌不能取得标本的情况下，对比组织活检，液体活检属于退而求其次的方法。

清风寡欲

一、肺癌流行病学
肺癌，是中国年发病率最高的癌症，约73万（2015年数据），在全球范围内，每年有近160万人死于肺癌（男性110万，女性近50万，2012年数据）。在中国，肺癌年死亡人数占全部癌症死亡人数的21%，约61万（2015年数据）。近年来，随着手术及药物治疗的完善，肺癌全球5年生存率仍在10%-20%之间。
肺癌发病率的变化和烟草的使用关系密切。比如，烟草使用量已经达到顶峰的国家（美国，英国，丹麦等），肺癌的发病率正在下降，男性的发病率在男女发病占比中也趋于稳定，并且有些国家（比如西班牙，匈牙利，烟草的使用量也已经达到峰值），肺癌在男性中发病率呈下降趋势，反而妇女的发病人数正在增加。在烟草使用量正在上升的国家中（中国，印尼等），肺癌的发病率仍在上升。在吸烟者中，慢性阻塞性肺疾病（COPD）是肺癌发病的最大风险因素。烟草烟雾激活了引起COPD和肺癌的共通的信号通路，突变经过成年累月的积累，最终引发了癌症。
影响肺癌发病的最大风险因素是吸烟，但是只有10%的烟民最终发展成肺癌。这表明，其他因素也影响肺癌的发生。除吸烟外，暴露于空气中其他成分（如建筑材料）等也是引起肺癌的主要原因。此外，室内空气污染，如烹饪烟气，煤炭燃烧，二手烟，石棉，各种金属，辐射污染物，有机化学物质，部分饮食因素，职业相关性疾病（如橡胶制造，室内装修，油漆等都和肺癌的发病相关。另外，人乳头病毒感染，结核病也会增加罹患肺癌的风险。亚洲女性也是受肺癌困扰的一大类人群，但她们无吸烟史，患肺腺癌的发病率较高，通常情况下伴有EGFR突变或ALK融合。
流行病学数据表明，影响肺癌发生的关键因素可总结为肺部吸入空气的质量，烟草烟雾，橡胶，建筑材料，油烟气等扮演者重要角色；病毒和细菌感染也对肺癌的发生有影响。亚洲女性患肺腺癌较高的概率也说明肺癌的发生有人群的特异性。
二、肺癌的遗传性与易感性
即使在相同的环境中，患者个体间基因的差异也可能导致在多年后是否患癌。癌症的发生取决于基因与环境的相互作用。大多数肺癌的致病原因可归结于吸烟，暴露于呼吸道和肺实质中的自由基，芳香胺，多环芳香烃，亚硝胺等是强致癌物。但大约15%的男性肺癌和50%的女性肺癌与吸烟无关。未吸烟罹患肺癌的年轻女性的总预后要比因吸烟罹患肺癌的总预后要好。宿主对肺癌的易感性是因个体而差异的，如吸烟患者患癌，吸烟患者不患癌，不吸烟患者患癌等。因此，大规模的数据研究是必要的，探究遗传因素在肺癌发病过程中的作用。
肺癌的发病，在个体层次之上，表现为家族聚集性，这其中，DNA修复基因的多态性，代谢酶的遗传多态性，是家族聚集性肺癌发病的主要因素。生物体在代谢，毒素等外来物质的过程中，如药物，外源物质会通过多种方法诱导代谢酶的表达，而很多时候，代谢酶可以将外源物，代谢成成活性物质或者致癌物等中间产物（这也从另一个角度说明了化疗药物是致癌药物还是治癌药物），比如参与物质代谢的细胞色素P450系列，是重要的I期代谢酶，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是重要的II期代谢酶，III期转运蛋白，包括P-糖蛋白，多重耐药相关蛋白（MRP）等与药物的生物转运和排泄相关。
细胞色素CYP代谢酶具有多样性，如CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2A6，CYP2E1和CYP3A4等都可以代谢烟雾中的致癌物，CYP1A1和CYP1B1参与烟雾中多环芳烃的代谢，CYP2A6和CYP2E1参与烟雾中亚硝胺的代谢。CYP代谢酶可将Benzo(a)pyrene(一种多环芳烃)代谢为BPDE(一种致癌物)，BPDE可以和DNA共价结合从而破坏DNA结构，比如和TP53基因的157,248,273位的G碱基结合，从而导致TP53的热点突变。
CYP的多态性和肺癌的发生具有一定的关联，如CYP1A1 m1等位基因，可增加酶的活性，m2等位基因也可增加酶的活性，通过代谢烟草致癌物形成中间体，进而和DNA共价结合而引起变异，m3等位基因则属于非洲裔美国人。
除细胞色素CYP代谢酶外，其他代谢酶，如GST，NQO1，不同的多态性，都在代谢一些有毒物质过程中形成致癌物，进而引起癌症的发生。除代谢酶外，DNA修复相关基因，如XPC，XRCC1，ERCC2等，其多态性也都和肺癌发生相关。
基因的多态性位点是因人群而有差异的，目前有多种SNPs研究开展，而有些多态性在代谢一些物质时，在体内产生了有致癌性的中间物质，进而促进了肺癌的发生。Drug--->SNPs--->carcinogen。在这个线性关系中，Drug，SNPs，carcinogen的全面阐释有助于我们降低肺癌的发病率。
三、肺癌发生的干细胞理论

传统上，用于解释癌症发生的理论为“克隆进化论”，认为，肿瘤内的每个肿瘤细胞都具有相同的致癌潜力。癌症干细胞理论认为：在癌细胞中，有一小部分具有干细胞的功能，其具有自我更新能力，可分化为其他细胞，并形成新的肿瘤，癌症干细胞能够抵抗化学治疗和放射治疗，导致肿瘤的复发，患者的预后也比较差。癌症干细胞理论有效的解释了癌症为什么会复发，化疗效果差。
四、肺部肿瘤分类
WHO 在2015年对肺部肿瘤在组织学上做了新的分型，其中大类如下：   

• 上皮细胞肿瘤（Epithelial tumors)
  
• 间充质细胞肿瘤（Mesenchymal tumors）
  
• 淋巴组织细胞瘤（Lymphohistiocytic tumors）
  
• 异位起源肿瘤（Tumors of ectopic origin）
  
• 肺部转移瘤（Metastatic tumors）
  

在这其中，占比最大的是上皮细胞肿瘤（Epithelial tumors)，临床药物最多，分子分型最明确。其中细分如下：

• 腺癌
  
  
  
  • Lepidic adenocarcinoma
    
  • Acinar adenocarcinoma
    
  • Papillary adenocarcinoma
    
  • 等
    
  
  
• 鳞状细胞癌
  
  
  
  • Keratinizing squamous cell carcinoma
    
  • Basaloid squamous cell carcinoma
    
  • 等
    
  
  
• 神经内分泌瘤
  
• 大细胞癌
  
• 腺鳞状癌
  
• 梭形细胞癌
  
• 等...不再列举（）
  

基于发生机理，治疗方案，预后，可将其分为两大类：非小细胞肺癌（NSCLC，约80%左右，分为鳞癌和非鳞癌两类），小细胞肺癌（SCLC，约20%左右）。在NSCLC中，占比最高的，为非鳞癌中的腺癌，分子分型明确，测序意义明确，非抽烟患者，药物靶点多（会在下文提到），预后较好。
五、肺癌的分子病理学
在以肺癌组织结构为基础的众多亚型中，分子病理发展最明确的是非小细胞肺癌，其中的Driver基因包含KRAS，EGFR，BRAF，ALK，MET，ERBB2，ROS1，RET，NTRK等，但不同驱动基因的占比会在人群中有所差异，比如亚洲人群中，EGFR的占比较高。此外，随着技术的不断进步，还有很多Driver基因等待被发现。




另外，对小细胞肺癌而言，目前并无明确的分子病理概念提出，药物治疗上也是主要以化疗药物治疗为主，但现在有一些免疫治疗药物在临床试验中。
故在谈肺癌的NGS检测，靶向治疗时，要避免诱导陷入误区，NGS检测会被发放大为基因检测，非小细胞肺癌的基因检测会被放大为肺癌的基因检测。在临床上，有用的是有限的。目前来看，基因检测，能涵盖的是肺癌\肺部肿瘤的一部分；NGS检测，能兼顾的，更是其中的一小部分。
六、详解肺癌分子标记物
1、非小细胞肺癌
非小细胞肺癌NCCN指南，提到了NGS，RNA-based NGS，PCR，Sanger Sequencing，SNaPshot，MassARRAY，FISH，IHC等检测方法。并且，指南提出，单一的NGS panel 检测并不能完全覆盖多种类型的突变，故在临床实际应用中，要明确常见的基因及其变异类型，是否能够使用，是否适合使用NGS检测，如果NGS panel无法检测所有的变异类型，应考虑多种检测方法的联合，比如用RNA-NGS检测融合基因变异，FISH检测拷贝数扩增，结构变异等，IHC用来检测蛋白高表达。
NCCN指南2020版，对非小细胞肺癌（Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC, 肺腺癌，肺鳞癌，大细胞癌为主），常见的靶点，突变类型，及药物信息如下：
NCCN指南提到的用于治疗或有参考意义的分子标记物：

• EGFR
  
  
  
  • 变异类型：突变 | Exon 19插入缺失，L858R，L861Q，G719X，S768I突变，T790M突变，exon 20插入。
    
  • 检测方法：首推NGS突变检测，panel设计可涵盖EGFR全部位点。如果选择Real-Time PCR, Sanger Sequencing, 因为灵敏度较差，需要对肿瘤组织做富集，使突变检出概率变大，T790M的检测可采用数字PCR的方法。
    
  • 药物举例：Osimertinib, Erlotinib, Afatinib, Gefitinib, Dacomitinib | Ramucirumab, Bevacizumab，在药物联合使用过程中，会涉及到多种其他靶点药物，如何VEGF/VEGFR靶点相关的Bevacizumab会用于多种肿瘤的临床治疗。
    
  • 耐药性：EGFR一线药物治疗之后，耐药是临床面临的最大问题，目前，已经阐明了许多耐药Biomarkers，比如T790M引起的二级突变，met扩增，NSCLC向SCLC的转化，EMT，PTEN缺失，KRAS突变，CRKL的过表达，MicroRNA变异等。
    
  
  

• ALK
  
  
  
  • 变异类型：融合 | EML4-ALK融合，其他形式融合，如KIF5B-ALK，TFG-ALK。
    
  • 检测方法：对EML4-ALK融合检测，首推FISH和IHC，其中FDA批准的ALK[D5F3] CDx Assay可单独使用，不需要FISH验证。NGS可以使用，也可用来检测多种类型ALK融合。
    
  • 药物举例：Alectinib, Brigatinib, Ceritinib, Crizotinib
    
  • 耐药性：ALK融合应对一代药物出现的耐药主要表现在ALK自身突变，ALK扩增引起的信号放大，EGFR的激活，KRAS突变，c-KIT突变，IGF-1R突变等。
    
  
  
• ROS1
  
  
  
  • 变异类型：融合 | 融合partner，CD74，SLC34A2，CCDC6，FIG。
    
  • 检测方法：FISH, IHC (特异性较差), NGS, Real-Time PCR
    
  • 药物举例：Crizotinib, Entrectinib, Ceritinib
    
  
  
• BRAF
  
  
  
  • 变异类型：突变 | BRAF V600E
    
  • 检测方法：Real-time PCR, Sanger Sequencing, NGS，BRAF突变在肺癌中常见的为V600E位点突变，在其他肿瘤中也是，如结直肠癌，黑色素瘤等，其中在结直肠癌和肺癌中，V600E也常常是EGFR耐药出现的下游信号通路突变。其检测可用来判断耐药并匹配相应的靶向药物。
    
  • 药物举例：Dabrafenib, Vemurafenib | Trametinib
    
  
  
• KRAS
  
  
  
  • 变异类型：突变 | G12。除G12突变常见外，仍有G13，A146等位点突变有临床意义。KRAS突变与EGFR耐药相关。
    
  • 检测方法：Real-time PCR, Sanger Sequencing, NGS。
    
  • 患者预后较差，EGFR用药性耐药。目前，针对KRAS基因并无临床上市药物，虽从信号通路考虑下游药物的可能性，但其效果不佳。
    
  
  
• NTRK
  
  
  
  • 变异类型：融合 | NTRK1\2\3和其他基因，为FDA批准的非适应症靶向位点，针对有NTRK融合的各种癌症的检测和治疗，肺癌中NTRK突变量较少。
    
  • 检测方法：FISH（至少三个探针），IHC，PCR，NGS，如需检测NTRK1、3的融合，则需要RNA-Based NGS。
    
  • 药物举例：Larotrectinib, Entrectinib
    
  
  
• MET
  
  
  
  • 变异类型：扩增，Exon 14跳跃突变
    
  • 检测方法：NGS
    
  • 药物举例：Crizotinib
    
  
  
• ERBB2
  
  
  
  • 变异类型：扩增，突变。在肺癌中，ERBB2的变异主要以20插入为主，扩增较少。为EGFR耐药相关基因突变。
    
  • 检测方法：FISH，IHC，NGS，PCR，Sanger Sequencing
    
  • 药物举例：Ado-trastuzumab emtansine
    
  
  
• RET
  
  
  
  • 变异类型：融合
    
  • 检测方法：FISH，ICH，NGS
    
  • 药物举例：Cabozantinib, Vandetanib
    
  
  
• TMB
  
  
  
  • 变异类型：突变
    
  • 检测方法：NGS | 目前，行业内没有评估TMB的专家共识。TMB与免疫治疗的疗效是因免疫治疗药物而又差异，还是一概而论，也是值得临床深入研究的话题。
    
  • 药物举例：Nivolumab | iplilimumab
    
  
  
• PD-L1 expression positive (>=%50) & EGFR, ALK, ROS1, BRAF Negative
  
  
  
  • 变异类型：蛋白高表达
    
  • 检测方法：IHC，因为检测的是蛋白表达水平，故只有此一种方法，但检测试剂多种多样，详见下图。相比于TMB，他的优势是价格便宜，但IHC的劣势是结果判断主管因素大，而TMB则更加数据化。如果PD-L1表达对免疫治疗预测的优势大于TMB，则其在临床上的竞争优势会更加明显。且目前来看，PD-L1的优势是大于TMB的。
    
  • 药物举例：Pembrolizumab, Nivolumab | Ipillimumab, Carboplatin, Cisplatin, Pacilitaxel
    
  
  

其他分子标记物：

• FGFR1/2/3
  
  
  
  • 变异类型：扩增，鳞癌较多
    
  • 目前有多个靶点药物处于临床试验中，虽是靶点，但靶向性较差。
    
  
  
• PIK3CA
  
  
  
  • 变异类型：突变，E542，E545突变较多。
    
  • 为PI3K-mTOR-AKT信号通路的关键基因的亚蛋白，和KRAS等多种基因一样，广泛存在于各种细胞中，其作为药物靶点存在，毒性相必较大，如果选择下游mTOR作为靶点，专一性较差。
    
  
  
• PTEN
  
  
  
  • 变异类型：缺失，鳞癌较多。
    
  • 抑癌基因带给我的感觉是，预后差，无靶向药物（化学小分子药物），从原理上来说，难以实现，所以TP53等基因的药物开发转向了蛋白方向，或者针对表达的RNA进行药物开发。
    
  
  
• DDR2
  
  
  
  • 变异类型：突变，鳞癌较多
    
  
  
• TP53，STK11等
  
  
  
  • 变异类型：点突变，缺失。
    
  • TP53基因普遍存在于许多肿瘤中，并且在正常细胞中扮演者重要的作用。在癌细胞中，有几个显著类型的突变，因为是抑癌基因，预后差，无靶点，且因为蛋白较小，KRAS蛋白也小，难以折叠成较为复杂的空间结构，预示着他和小分子的作用转一性较差。
    
  
  

目前，随着测序技术的发展，越来越多的突变基因及突变类型被发现，但多数仍无针对性的靶向药物或者基因的临床意义并未明确，比如突变引发的恶性程度，预后状况等，故目前，临床上仍无针对性的检测方案，多数基因检测公司都通过NGS判断突变，但映射到临床上，如何判断用药，指导预后，仍需很多工作。比如，如何有效的指导FGFR/1/2/3患者参与临床试验，根据信号通路给出的靶向PIK3CA下游的药物为何有理论上的有效性，是否真有临床有效性。一系列的临床研究工作仍需开展。
2、小细胞肺癌
NCCN指南在2020版中为列出Biomarkers。
一般而言，SCLC和NSCLC在基因突变类型上，无明显的相关性，几乎所有SCLC都伴有Rb基因的失活突变，并且TP53的突变频率较高。除此之外，一些染色体区域，比如染色体1，3q，5p，6p，12，14，17q，18，19，20拷贝数增加，3p，4，5q，10，13，16q，17p拷贝数降低，端粒酶活性也增加，预示着预后较差。另外，很多研究表明，c-kit，IGFR1，MYC，FGFR1，NOTCH家族，Hedgehog信号通路，EP300，FHIT，p16INK4，DNA修复基因等靶点的存在，鉴于临床对SCLC中此类靶点认知较为浅显，基因检测所能带来的帮助也是有限的。
SCLC的突变基因较多，突变类型多样化，并且多数突变基因为抑癌基因，如突变频率最大的Rb1和TP53，SCLC目前并无靶向药物，但BCl-2，MCL1，PMAIP1等与细胞凋亡相关的靶点未来可能会有靶向药物。




目前，针对血管生成相关信号通路，有一些研究在SCLC中开展临床试验，多为已经获批的其他癌症药物。如VEGFA靶点的药物贝伐单抗，VEGFR，BRAF等多靶点抑制剂索拉非尼等。但血管生成相关靶点药物，使用前，无需判断靶点状态，即无需通过PCR，NGS等方法的检测。
七、检测技术方法
在实际临床应用中，NSCLC的基因检测，应根据检测样本类型（组织样本or血液样本or其他），DNA，RNA或者蛋白等条件，综合评估可以选择的检测方法。目前，临床应用较为广泛的仍是：基于PCR的方法，基于FISH的方法，基于IHC的方法（蛋白检测），基于NGS的检测方法。下表列出了FDA批准的针对肿瘤靶点的应用于临床的检测方法（囊括了以上四种，引自FDA）。














1、基于PCR的检测方法

对于明确的检测位点，可以选择PCR的检测方法，比如罗氏cobas EGFR mutation test，检测EGFR 19 exon缺失，L858R突变，用于指导erlotinib一线治疗转移性NSCLC。其优点是检测特异性较高，缺点是只能检测试剂盒设计的41个已知EGFR变异，无法检测未知变异位点。此类试剂盒还有Therascreen EGFR assay，以及ARMS-PCR等都是基于PCR技术的延伸。在国内，获批的试剂盒也较多，有单点的，也有多点的。下表列出了不同的PCR技术与之相对应的敏感性。数字PCR检测灵敏度较高，可用于血液中ctDNA单点突变的检测，如EGFR T790M耐药位点的检出和监测。
目前，基于PCR的检测方法，仍是许多检测手段的验证方法，比如NGS测序中的低频位点，仍需通过PCR的方法进行验证。
在NSCLC的基因图谱中，EGFR，KRAS，BRAF，ERBB2等常发生点突变和插入缺失的基因，可以选择用传统PCR的方法进行检测，目前，无论是FDA，还是NMPA，在EGFR检测上，都批准了很多用于突变检测的基于PCR技术的检测试剂盒。
2、基于FISH的检测方法

拷贝数扩增，基因融合仍采用FISH检测的方法，NGS为新技术，但FISH为金标准，NGS检测的位点仍需FISH验证。
FISH技术利用杂交的原理，用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或者细胞核特定的靶DNA序列杂交，通过荧光显微镜观测荧光信号位置，大小，数量，来判断序列，缺失，扩增及融合的情况。比如用于EML4-ALK融合的基因检测：分别设计两个探针，一个用来检测染色体2p23位点的ALK基因，另一个用来检测染色体2p21位点的EML4基因，可用来判断这两个基因发生融合的情况。如上表中Abbot的检测试剂盒。除ALK之外，ROS1的基因融合也会用FISH检测。贵。




3、基于IHC的检测方法
免疫组化是对蛋白的检测。可以用来检测EML4-ALK融合蛋白，HER2蛋白（）等，但其灵敏性较差，即若EML4-ALK融合蛋白表达量低，即使提高IHC检测的灵敏性，也未必能检出融合蛋白。IHC的最大优点是便宜快速。目前，对PD-L1蛋白的检测，采用免疫组化的方法，FDA已经批准了多种抗体（见第五部分PD-L1药物与抗体检测表），因PD-L1基因和蛋白的不相关性，对PD-L1蛋白的检测，无替代性。若TMB被证实预测免疫治疗有效性更好，则灭掉PD-L1 IHC检测的，是“跨界”。
4、基于NGS的检测方法

NGS用于肺癌临床检测过程中，出现过很多模棱两可，夸大事实的产品推广。NGS检测项目的目的应当和临床更加明确的结合。比如，如果检测的目的是用来判断靶向药物的使用，那么检测结果该明确靶点靶点变异信息和对应的靶向药物治疗方案。在实际操作中，应明确列入肺癌检测项目的基因list，并明确临床意义，是用于靶向治疗，分子分型，疗效预测还是预后判断。因为NGS检测设计多种基因，并且同一基因的不用突变形式都可能被覆盖到，比如SNV，indel，SV，CNV等。对基因进行分类，比如引起肿瘤发生，转移，耐药的驱动基因，特异靶点上下游的关键突变基因。
基因数量的增加，引起了数据信息量的增加，进而增加了去伪存真的过程，比如无用信息的舍弃，有效信息的甄别等。在实际肺癌检测应用中，检测基因的数量的增加不应以增加检测的成本和检测后面临的负担。要明确不同基因在肺癌中所扮演的不同意义，有大有小，有的暂时无意义。
八、肺癌免疫治疗
在前面已有简单阐述，更详细内容，可参考文章：
以小见大 || 关于肿瘤免疫治疗，还有很多...

九、液体活检
循环肿瘤DNA（ctDNA）是从肿瘤细胞脱落进入机体循环系统的cfDNA，DNA可能通过从活的肿瘤细胞中以游离DNA的形式分泌到血液中，也可能存在于细胞衍生的囊泡中，被称为外泌体，或者肿瘤细胞坏死或者凋亡后会进入血液循环系统。进入血液循环系统中的DNA在血液中存在的时间较短，半衰期大约2小时，序列长度大概在180-200bp之间，因为肿瘤细胞的ctDNA中含有体细胞突变，故比较容易和cfDNA区分开，但即使恶性程度较高的肿瘤，释放了较多的ctDNA到血液中，其在cfDNA中的占比也大约只有1%左右。故不同患者的ctDNA差异较大。
在实际检测中，因为从患者血液样本中提取DNA进行检测分析，相比传统上的组织检测，具有无创的特点，并且更多的研究表明，肺癌组织中的基因突变和ctDNA之间存在关联性，因此，ctDNA作为组织检测的补充而更加具有优势，并且ctDNA也越来越在肺癌与研究中作为诊断和预后判断的工具。比如，他可以弥补肿瘤在时间和空间上的特异性，可以试试的监控患者的突变负荷。
因为ctDNA在血液中含量少的缘故，检测技术必须具有更高的灵敏性，常规的检测方法是NGS和数字PCR，数字PCR的灵敏度约为万分之一，并且准确性较高。但在临床端，目前，EGFR T790M位点的检测，国家已经批准了数字PCR平台做血液检测；但对于采用NGS方法检测血液样本，特别是检测基因数量为几百个时，其中的科研意义肯定是巨大的，但临床意义，现阶段，能解决的问题还是有限的。
液体活检何时【C位】出道

最后，梳理一个逻辑：
肺癌基因检测说的是，肺癌中非小细胞肺癌的基因检测，说的是非小细胞肺癌中几个Driver基因的基因检测；说的是非小细胞肺癌中几个Driver基因基于不同检测方法的基因检测。

肺癌基因检测 （宣传）> NSCLC基因检测 > NSCLC中Driver基因检测 > NSCLC中Driver基因不同检测方法的基因检测（现实）。
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