血泪教训，Western blot最全避雷手册。

营养师

以下文章来源于聊点学术 ，作者Mark

谨以此文，纪念那些年我做过的Western blot。
                               —— 一位不愿透露姓名的科研民工



提起Western blot (WB)，很多人都能哭诉半宿。



这是一个基础实验，也是一个让大家头疼的实验，简称“玄学”。


话不多说，做过的都懂。



今天给大家提供WB最全避雷手册，希望大家能愉快实验，顺顺利利。

This    is    the    dividing    line.
<hr/>
倾 尽 全 力，长 文 预 警

1、WB有什么优点？
答： 灵敏，可达ng级，用ECL显色法可达pg级。灵敏，相对便宜且特异性高。

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？
答：a) 你的细胞中并不表达这种蛋白质，换一种细胞或查文献弄清楚；
       b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；
       c) 你的抗体不能识别目的蛋白，检查抗体说明书，看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？
答：a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右；

      b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时需再加入适量上样缓冲液。

4、我做的蛋白质分子量很小(10KD左右)，请问怎么做WB？
答：尽量选择0.2μm的膜，缩短转移时间；也可将两张膜叠在一起再电转。
5、我的目的带很弱，怎么加强？
答：最主要是加大抗原上样量；同时也可以将一抗稀释比例上调。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？
答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？
答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新进口的显色底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
b) ECM底物中本身含双氧水，不稳定，见光或温度高时易失活；现配现用。
c) ECL底物没覆盖到相应位置；
d) 二抗时间过期，或平时使用不当导致二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；
b) 显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。
10、DAB好还是ECM好？
答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到检测的阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。具体选择还是要看你实验的情况，目前大家一般使用ECM。
11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？
答：a)所检测的抗原形成二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。
b)蛋白本身有修饰如糖基化、磷酸化等均会增大蛋白分子量。
12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？
答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够。(注意！Marker并不是蛋白是否转移到膜上的标准，它只是为我们提供简单的指示作用。)
13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。建议可多种抑制剂混合使用。
14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和WB试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：a)免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；WB可以特异性检测某个蛋白质分子，如抗体选择合适，灵敏度很高。WB进行定量，但是不能定位。
b)两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
15、做WB时，提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂)，用了一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了一种一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
答：怀疑是样品问题，可能是：
a)样品不能反复冻融，建议制备好样品后混匀，小体积分装；
b)样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WB过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂(PMSF在水溶液中不稳定，30min就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1小时，补加1次。见水易分解，使用前加入)。
16、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？
答：一般5×10^6就足够了；特殊情况需根据自己的研究来确定。
17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对WB有无影响？
答：能，完全没有问题；这是两个不同的实验。
18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品；有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。

19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丢失较少。
20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以减少电流延长时间，加20％甲醇；还有一种办法就是采用最新的WES来检测，灵敏度极高，但价格贵。

21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WB吗？
答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。
22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。
23、蛋白变性后可以存放多久？
答：-80℃，若没有反复取出冻融，保存一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
24、我所测定的蛋白分子量是100KD左右，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意目的条带位置肯定会发生一定地偏移。
25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含较多的生物素，用BSA(5%、8%)代替会好一点。
26、一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
答：WB一般上样30-100μg不等，结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了。当然有的蛋白不适合WB的怎样做也不行，或者抗体效价低则注定事倍功半。
27、做组织样品的WB的时候，怎样处理样品？
答：必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(12000转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
28、大分子量蛋白200KD或以上，在做WB要注意什么呢？
答：做200KD蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；胶很软，剥胶时要小心；转移时间需要相应延长(至少300mA，3h或以上)；必须要使用大量程的Marker(否则出现杂带不知如何分析问题)。
29、有什么方法可以提高上样量？
答：a)可以浓缩样品；或增大上样体积来增大上样量；
b)用5X的上样缓冲液来稀释变性。
30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WB则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了，但是不要超载。
31、一抗，二抗的比例是否重要？
答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉大部分的非特异性底色。
32、要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求？
答：主要是一抗要选择好。对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
33、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？
答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称抗原表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，蛋白煮后变性其构象会消失，仅剩下一级结构。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般我们做的时候没有这么复杂的考虑，多看看抗体说明书所注明的实验范围来做，这样省时省力。
34、WB中抗体的可以重复应用吗？
答：所有的抗体工作溶液一般不主张回收冻存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
35、在做WB时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？
答：肯定可以，建议先检查非磷酸化蛋白，然后使用抗体洗脱液将抗体洗去，再在该膜上重新孵育磷酸化一抗。
37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？
答：这是正常的，大分子的蛋白转移很慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡(转过的表现)。注意一点：丽春红染色较好，不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准，这是两个概念，；丽春红染色很多时候只是提供一个粗略的参考而已。
38、做WB时，同样的抗体在免疫组化能做出，而WB却不能？
答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和免疫组化。
39、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？
答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。建议尽量还是裁剪膜，不要整张膜孵育，费抗体而且可能会孵育不均匀(个人建议，仅供参考)。
40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液；小编发现电泳时产热也很厉害，其实可以在电泳时加冰浴。
41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？
答：没有问题，就是你胶里的水分被电泳产热蒸发了。其次配好的胶在过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点电泳液保持湿度就可以了；也可能30%聚丙酰胺有问题，你可以重新配制一份试试或直接买商用的30%聚丙酰胺；能够替换的试剂，尽量换一下，选用进口试剂。
42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
答：这么广的分布不好转移，一般建议：21KD和66KD可以一起转，一起做。采用12％SDS-PAGE，湿转120mA，45-60min就可以了，可以根据你实验室师兄师姐的调节；而170KD蛋白用7%SDS-PAGE，至少200mA 120min。
43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜(0.2μm)。
44、我用的是可视Marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。Marker是新买的。
答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择，现在已经有商用梯度胶了，大家可自行选择。
45、是否WB实验半定量一定要加内参？
答：对于发表文章的实验一定要加内参，实验严谨，证据充分。
46、核内抗原WB内参选择什么合适？
答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，动动手查查就可以选出你要的内参。(也可以私信小编哦)
47、做半定量WB，内参β-actin，GAPDH哪个好？
答：一般选用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代谢这方面的研究还是尽量选择β-actin。
48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持冰浴，保持低温。除非有文献特别指明必须使用特殊方法，一般来说没有区别。
49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST的T是Tween吗，浓度是多少？
答：T就是Tween，全称Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST)，组成：8g NaCl，2.42g Tris base，加水800mL充分溶解, 加 500-1000μL 的 Tween-20，用HCl 调节pH 至 7.4，加水定容至 1L。
50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?
答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。小编建议尽量还是4℃过夜孵育，原因在上面已说明。
51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
52、怎样才能跑出漂亮的胶，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？
答：影响跑胶跑的质量，提供2个小建议：
a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。
b)胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。
53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?
答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。
54、电泳中常出现的一些现象：
①“︶” 条带呈笑脸状
原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高，而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形，所以因为赶时间而加大电压可能会出现这个)。
②“︵” 条带呈皱眉状
原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
③条带拖尾
原因：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
④纹理(纵向条纹)
原因：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。
⑤条带偏斜
原因：电极不平衡或者加样位置偏斜，一定要子平面台子上电泳，胶要做好。
⑥条带两边扩散
原因：加样量过多，弥散至孔周围了，减少上样量或者使用5X上样缓冲液。
55、WB结果中背景较高
可能的原因及建议：
①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。
②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。
③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。
④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。
⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。
⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。
56、WB结果中杂带较多
可能的原因及建议：
①目的蛋白存在多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点等等)，本身可以出现多条带。查文献或生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，去除修蛋白饰后确定蛋白实际大小，这个需要一定的生物化学基础和生信分析能力。
②目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析其可能性。
③样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂；样本处理在冰上操作。
④上样量过高，过于敏感，适当减少上样量。
⑤一抗特异性不高，重新选择或制备高特异性的抗体。
⑥一抗不纯，纯化抗体。
⑦一抗或者二抗浓度偏高，适当降低抗体浓度。
57、WB结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议：
①你所检测的样本中不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，同时查阅文献。
②检测样本低表达目的蛋白，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
③转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
④抗体不能识别测试种属的相关蛋白，购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
⑤一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜。
⑥二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。
⑦洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
58、其它现象：
①膜上多处出现黑点或黑斑，原因有2点，抗体与封闭试剂发生非特异性的结合；或者配的奶粉没有充分溶解，奶粉团粘在膜上而没洗干净。
②反白(条带显白色)，原因一般是目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
③蛋白分子量偏低或偏高，原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。
59、安全
爱护身体，保护自己。安全第一，实验第二。安全无小事！操作有毒试剂时，一要定带手套和口罩，且操作挥发性试剂一定要在通风橱中进行。

This    is    the    dividing    line.
<hr/>
以上为本期内容。简单地为大家提供一些建议，希望大家的实验能顺顺利利，早日完成SCI大业!

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/380838036