流式细胞术检测细胞凋亡(FITC-PI)

HaHa

实验方法

1．用6孔板培养细胞，待细胞生长达到60%-70%，吸出旧培养基，根据实验需求处理，继续培养。
2．根据实验处理时间，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。（注意：悬浮细胞不需要胰酶消化，直接收集到离心管即可）
3．加入步骤（2）中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤（2）中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC导致染色失败。
4．取5-10万重悬的细胞，200g离心5 min，弃上清，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
5．加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
6．室温(20-25℃)避光孵育10 min。可以使用铝箔进行避光。
7．200g离心5 min，弃上清，加入190 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。
8．加入10 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。
9．进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
注意：FITC为绿色荧光，此检测方法不适用于已带绿色荧光标签的细胞
结果示例及分析
四个象限的意义
左上/P2-Q1：坏死细胞；
右上/P2-Q2：晚期凋亡细胞；
右下/P2-Q3：早期凋亡；
左下/P2-Q4：未发生凋亡的细胞。
细胞凋亡率：P2-Q2与P2-Q3象限百分率的和。



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