生物小白的入门必修课——细胞培养

乔帮主

做细胞生物学实验呢，细胞养不好，那做实验犹如无米之炊
    庾澄庆有句歌词叫做，“蛋炒饭最简单也最困难”。养细胞亦是如此，虽说流程就寥寥几步，但稍不留神，细胞就不明不白“闹起脾气”。不是细胞污染，就是活力不佳，再或长着长着就不再是最初的模样。
    所以我们常说，养细胞要有耐心。这做实验其实跟出家是一样一样的，心态要好，动作要稳，功夫要到家，头发也得掉。


    细胞培养的训练，从三个方面做起。首先，应当熟练掌握贴壁细胞的换液的基本流程，能够动作干脆，将无菌操作训练形成肌肉记忆和意识本能。其次，是进行细胞传代的训练。当前两个基本操作都掌握之后，便可以冻存实验生涯中的第一管细胞了。
一、单层贴壁细胞的细胞换液
    细胞换液是一项最常规的操作，通过移除旧的培养基并更换新的完全培养基，以达到清除细胞生长过程中的代谢废物并补充新的营养物质的目的。
1.操作准备阶段：    准备好所需的实验耗材，所有耗材均需要经过高温灭菌处理。另外，我们还需要培养基、血清、平衡盐溶液（D-Hanks或PBS）、装有75%乙醇的酒精喷壶、废液缸等。固定设备包括超净台、移液枪等则不逐一列出。
所有的物品均需经过紫外传递窗，紫外照射灭菌至少半小时后，方可入传递窗。每日首次使用细胞间前，亦需要开启房间紫外照射半小时。房间大紫外照射完成之后，开启层流净化系统，通风20分钟以上，方可进人，避免房间残留的臭氧影响健康。此处强调，存在部分对温度尤为敏感的细胞，此类细胞培养前，需要将培养基与血清在恒温箱中预热后使用。 我们强调，所有的无菌液体在转移或是保存时，应当稳定，避免内部液体晃至瓶口。相对于无菌液体容器的内壁，其瓶口是污染的危险区域，晃至瓶口的液体再逆流回容器内，可能大大提高污染的概率。
    耗材及试剂准备完毕后，洗手，准备进入细胞间。第一更衣室内，穿上已提前照过大紫外的实验服，佩戴好口罩、帽子、手套。穿戴完好后，进入风淋间，待风淋吹去身上细小杂物后，进入细胞间。进入细胞间后，75%酒精喷洒双手
2.准备实验台面：
    老规矩，开篇强调实验台面的整洁。一个整洁的台面，反映着一个合格的实验员清晰的操作思路。本课题组的习惯，如下图摆放台面。在台面的正前方摆放移液枪，左前方摆放枪头和培养基等液体，右前方摆放灭菌离心管等。实验开始前，确认所需的耗材、试剂是否齐全。






3.观察细胞：
    从恒温细胞培养箱中取出细胞，于镜下观察。实验繁忙的时候，一个人可能养有几十瓶甚至百瓶细胞，即便如此，也不应当省去一一观察细胞的过程。磨刀不误砍柴工，及时发现轻度污染的细胞或是状态不佳的细胞，可以避免后续更加严重的时间、经历和经费的损失。    我们强调，取细胞的时候，养成不触碰培养瓶底壁的习惯。事实上，所有培养体系的底面都不应当用手触摸，尤其是后续需要测板子或拍照的相关培养体系，如96孔板、克隆培养板等。触摸培养体系留下的污渍，有时候会对测量结果产生巨大的影响。此外，如前文强调的，无菌液体要避免晃至瓶口。对于细胞培养瓶亦是如此。在端起培养瓶时，瓶口应当微向上，从而防止培养基晃至瓶口。


    肉眼观察细胞，主要是关注培养基是否清澈、有无肉眼可见的混浊、颜色是否发黄或是发紫。绝大多数的培养基中，都有添加酚红作为pH指示剂。细胞培养的过程，即培养体系酸化的过程。细胞生长代谢产生的各类代谢废物在培养基内堆积，即表现出培养基发黄，这提示我们，需要给细胞换液了。偶尔的，培养基也会发紫，这种情况往往是出现在培养箱故障，二氧化碳供给不足的时候。通常来讲，我们是每2~3天需要一次换液。当然，如果距离上次换液刚过一天培养基就发黄了，那么考虑是不是细胞密度太大了，就需要传代了。镜下观察细胞，主要是要关注细胞的形态是否良好、细胞的密度或汇合度如何、细胞周围的背景是否干净、有无污染迹象等等。确认细胞状态良好之后，就可以进入换液的阶段了。
4.细胞换液：    细胞培养瓶转移入无菌台，准备开始操作。
    换液的基本流程包括：抽弃旧培养基；D-Hanks清洗细胞，即加入1800μl的D-hanks，静置30s；抽弃D-Hanks；补入2700μl培养基；补入300μl血清。其具体的相关操作细节如下——    提前拧松所需液体的瓶盖，以备之后的单手开盖操作。移液枪提前调好量程再插枪头，一旦插上枪头就开始干净利落的移液动作。切勿插了枪头才开始慢慢悠悠调量程，甚至是将插了枪头的移液枪在台子里晃来晃去。不良的操作习惯都会大大增加污染风险。    由于超净台内层流方向自上向下，而我们的手只是喷了酒精，谈不上严格的灭菌，我们手上存在的潜在的细菌可能经由层流自上向下转移。因此，将无菌液体的瓶盖拧下后，盖子冒口应当向下放置。    打开瓶盖，瓶盖帽口向下放置于无菌区域。立即以一定倾斜角度握持容器瓶。吸取液体时，仅枪头部分伸进瓶口，移液枪柄避免伸入瓶口（强调严格无菌区域与清洁区域之间的过渡亦应当重视）。无菌液体使用后及时关闭瓶口，避免敞开的瓶口长时间垂直暴露在层流中。此外，还强调，操作全程尽量避免非严格灭菌的物品经过开口液体的上方。    吸弃废液可使用负压吸引器。若条件不允许，则使用移液枪抽弃废液时，枪尖距离废液缸口应保持一定距离，避免回溅的液体污染枪尖，进而被带入无菌液体或者细胞培养体系。








二、单层贴壁细胞的传代    细胞培养的操作细节在前一部分已经阐述，故这一部分主要描述一下传代的流程和相关步骤的意义。    1.吸弃旧培养液，等渗液清洗。清洗的目的一来是尽可能洗干净细胞的代谢废物，另一方面，也是为了洗去先前培养基中的血清。若无清洗步骤，则残留的血清足以干扰后续胰酶的消化效果。
    2.足量含EDTA的胰酶（300~400μl）覆盖贴壁细胞，前后倾倒培养瓶，铺匀胰酶。细胞的消化程度需在镜下观察，镜下见细胞间出现间隙即可中止消化。若见细胞变圆，甚至随着胰酶的流动而脱落，则消化严重过度，可能对细胞造成不可避免的损失。




    3.竖立培养瓶，待挂壁的胰酶流至培养瓶角落。移液枪及时吸出胰酶，补入培养基1800μl（900μl量程，两枪）。


    4.使用移液枪（900μl量程）反复吹打培养皿底部细胞，使细胞脱离。（视频背景风机杂音较大，建议静音后打开视频。）
    5.细胞悬液移入离心管，加5~10%血清，800~1200rpm离心5min。    6.离心完成后，移除离心管中上清液，注意保护离心管中的细胞团块。。    7.加入新的培养基，轻柔吹打细胞团块，重新悬浮并混匀细胞团块。    8.细胞计数或活细胞计数，根据细胞密度，计算稀释到合适细胞密度（5万/ml），接种至培养瓶。    9.镜下观察，培养瓶转入孵箱。
三、单层贴壁细胞的冻存    基本操作同前，本部分即简述流程。

• 确保细胞符合冻存标准——a)     外观健康，形态学特征良好；b)     处于生长对数期；c)     无污染。
  
• 准备冻存管，每瓶细胞准备一支冻存管（冻存液配比=600μl培养基:300μl血清:100μl DMSO）。
  
• 胰酶消化，转移至离心管，准备离心
  
• 离心时，可加适量血清（5~10%）；
  
• 离心完成后，去除上清液，使用1200ul培养基吹匀离心管内细胞；
  
• 离心管内加入600μl血清，小心吹匀，减少气泡产生；
  
• 逐滴加入DMSO共200μl（DMSO溶于水时大量放热，避免局部过热导致细胞热损伤），小心吹若干下，混匀液体；
  
• 转移细胞悬液进入冻存管，1ml/管，共2管；
  
• 冻存管梯度冷冻——4℃ 0.5h；-20℃ 2h冻存至固态；-80℃冰箱或液氮罐口（亦为-80℃）过夜，第二日再将冻存管没入液氮。或使用梯度冻存盒，常温下放入盒中，移入-80冰箱过夜，次日没入液氮
  

四、冻存细胞的复苏

• 液氮罐中取出冻存管，确认冻存管标签，37℃水浴，避免水没过管帽，持续摇动， 1分钟内即可融化。（注意液氮中取出后，避免长时间暴露于常温，或令其缓慢回温，此举可致细胞死亡率严重增加）。
  
• 冻存管内细胞悬液转移入离心管，以5ml/min（通常冻存管为2ml体系，则在半分钟左右再加入2ml培养基）的速度缓慢加入培养基，开始时逐滴加入，随后可渐加快，逐步稀释细胞和DMSO。
  
• 一定转速离心10min，去上清液；
  
• 培养基重新悬浮细胞沉淀，接种细胞至培养瓶；
  
• 24h后观察并确认细胞贴壁；
  
• 定期更换培养液，直至细胞系重新建立
  

利益声明：
本教程未涉及任何商业推广，所用试剂、耗材可根据各课题组需求酌情更换。
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