核酸提取的试剂有哪些厂商？一步法提取有哪些优缺点？

Rose

前不久知道了一步法，一步法具体做了什么，有什么优缺点么？有了一步法为啥还需要花大价钱去购买核酸提取仪

原文地址：https://www.zhihu.com/question/440319455

继续前进

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。




图源：百度百科

二为什么要进行核酸提取?
核酸分子的获取（核酸提取）是核酸分子检测必不可少的前处理步骤，而且从复杂的生物样本中分离出高纯度的核酸是确保高灵敏、高精确度检测的关键。

现今并非所有的核酸检测方法都需要从原始样品中提取核酸，但如果不对核酸进行提取和纯化而采取直接检测，样品中的杂质可能会影响检测结果的准确性。例如，如果某病毒样品中存在过多的RNA酶等杂质，可能会使得病毒RNA发生降解，而导致检测失败，此外，杂质还可能与检测试剂发生非特异性反应，干扰检测过程，降低检测敏感度等问题，甚至可能造成假阳性或假阴性结果。因此，为了实现目标物的精准检测，核酸提取是至关重要的实验步骤。
三核酸提取纯化方法及原理
核酸提取包括裂解和分离纯化两个过程。核酸是复杂的生物大分子，通常位于细胞核内，并与各种蛋白质结合在一起。为了获得高质量的核酸分子，需要将细胞进行裂解以释放核酸分子（裂解），并需要利用核酸与蛋白质等其他分子理化性质的差异，从混杂的溶液中将核酸分子分离出来（分离纯化）。同时，为了便于后续的研究，需尽可能保证核酸分子一级结构的完整性，并避免蛋白质、脂类物质和多糖等生物大分子的污染。



图源：健康守望角

3种裂解方法
核酸提取的第一步是样品裂解，释放核酸，该过程目的主要是将细胞或病毒中的核酸分子与其它生物大分子，如蛋白质,脂质，多糖链等，从细胞中释放。主要通过机械破坏、化学作用、酶催化反应三种方法的一种或组合实现，这三种方法的
对比如下表所示。



图源：健康守望角

基因组DNA常用裂解方法:CTAB:CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，高离子浓度与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不沉淀核酸。SDS法:SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去垢剂，高温(55-60℃)裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，在高盐环境下或降低温度后蛋白等结合形成的复合物沉淀，释放核酸。



图源：健康守望角

质粒DNA常用裂解方法
碱裂解-SDS法:在氢氧化钠(pH12.0-12.6碱性环境)和去污剂SDS的作用下细胞破裂，细菌蛋白质和染色体DNA变性，双链DNA氢键断裂，DNA变性。加入酸性高盐缓冲液后H恢复中性，共价闭合环状质粒DNA复性速度快于线性的染色体DNA。细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物被SDS包盖。之后复合物沉淀下来，质粒DNA留在上清中。




图源：健康守望角

煮沸法:含有Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中加热至100℃使细菌裂解。通过加热破坏细菌外壁的同时有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。温度下降后，闭环DNA形成超螺旋分子，离心时留在上清中



图源：健康守望角

5种纯化方法
通过裂解之后的样品往往包含多种物质，为了得到不含杂质的核酸，还需要进行纯化处理，常见的纯化方法主要有酚氯仿法、盐析法、玻璃珠法、离心柱法、磁珠法等，方法对比如下表。



图源：健康守望角

以上8种裂解纯化方法都有各自的特点，根据不同的实验要求（样本类型，纯度，数量）选用最匹配的方法， GBCBIO® 捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。
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哺乳动物组织	Cell/Tissue DNA Kit（GBCBIO-D2105）MagIso Tissue/Cell DNA Isolation Kit（GBCBIO-M7105）FFPE DNA Kit（D1705）
血液	Blood DNA Kit（GBCBIO-D1105）Fast MagIso Blood DNA Isolation Kit（GBCBIO-M3115）Relax-ISO Blood DNA Kit I（GBCBIO-D1201）Relax-ISO Blood DNA Kit II（GBCBIO-D1401）Blood DNA Maxi Kit（GBCBIO-D1301）
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植物	Plant DNA Kit（GBCBIO-D4105）Hpure Plant DNA Kit（GBCBIO-D5105）MagIso Plant DNA Isolation Kit（GBCBIO-M8105）
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水体	Water DNA Kit（GBCBIO-D2705）
真菌	FT Fungal DNA Kit（GBCBIO-D1605）Fungal DNA Kit（GBCBIO-D2605）Hpure Fungal DNA Kit（GBCBIO-D7105）
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样品类型	磁珠法试剂盒（品牌+货号）
血液	Fast MagIso Blood DNA Isolation Kit（GBCBIO-M3115-50
唾液	MagIso Saliva DNA Isolation Kit（GBCBIO-M1105-50
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动物组织/细胞	MagIso Tissue/Cell DNA Isolation Kit（GBCBIO-M7105-50
植物	MagIso Tissue/Cell DNA Isolation Kit（GBCBIO-M8105-50
细菌	MagIso Baterial DNA Isolation Kit（GBCBIO-M2215-50
血清/血浆/无细胞液体	MagIso Circulating DNA Isolation Kit（GBCBIO-M2105-50
土壤	MagIso Environmental Samples DNA Kit（GBCBIO-M4105-50
病毒	MagIso Virus DNA/RNA Isolation Kit（GBCBIO-M6105-50

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大力水手

作为一名在生物技术领域摸爬滚打20余年的老兵，我见证了核酸提取技术的飞速发展。从早期的酚-氯仿法到如今的磁珠法，每一次技术革新都为我们的研究带来了新的可能。今天，我想和大家分享一下磁珠法核酸提取技术，这个正在改变实验室工作流程的革命性方法。



磁珠法核酸提取流程

磁珠法的核心原理
磁珠法核酸提取的核心在于利用带有特定官能团的磁性纳米颗粒。这些磁珠在不同的pH值和离子强度条件下，能够选择性地结合和释放核酸。整个过程主要包括样品裂解、核酸结合、洗涤和洗脱四个步骤。
与传统方法相比的优势

• 操作简便：无需离心，大大简化了操作流程。
  
• 自动化程度高：可以轻松与自动化设备集成，提高实验效率。
  
• 安全性好：避免了有机溶剂的使用，降低了健康风险。
  
• 核酸质量高：能够有效去除蛋白质、多糖等杂质，获得高纯度核酸。
  
• 样本适应性强：从组织到血液，从植物到微生物，几乎所有类型的样本都能处理。
  

实际应用案例
我曾在一个肿瘤基因组学项目中遇到棘手的问题：需要从极微量的肿瘤组织中提取足够的高质量DNA用于全基因组测序。传统方法的提取效率难以满足要求，直到我们尝试了磁珠法。不仅提取效率显著提高，DNA的完整性也得到了很好的保持。这次经历让我深刻体会到了磁珠法在处理微量样本时的优势。



磁珠法提取核酸电泳实验结果

技术发展趋势

• 磁珠表面修饰：开发新型官能团，进一步提高核酸的结合特异性和效率。
  
• 自动化整合：与更多类型的自动化平台兼容，实现从样本到数据的全流程自动化。
  
• 单细胞应用：针对单细胞测序等新兴技术，开发专门的磁珠法解决方案。
  
• 即时检测(POCT)：将磁珠法小型化、便携化，用于现场快速核酸检测。
  

注意事项
尽管磁珠法操作简单，但要获得最佳效果，还是需要注意以下几点:

• 样本质量：新鲜样本通常能获得更好的提取效果。
  
• 裂解充分：确保样本完全裂解，释放出所有核酸。
  
• 磁珠选择：根据目标核酸(DNA/RNA)选择合适的磁珠。
  
• 洗涤步骤：严格按照推荐的洗涤次数操作，去除杂质。
  
• 洗脱体积：根据后续实验需求，选择合适的洗脱体积。
  

结语
磁珠法核酸提取技术无疑是实验室工作流程的一场革命。它不仅提高了实验效率，也为许多前沿研究提供了可能。作为一名长期工作在实验室一线的研究者，我深深感受到这项技术带来的便利。
如果你对磁珠法核酸提取感兴趣，或者在实验中遇到了提取效率低、纯度差等问题，不妨尝试一下这项技术。

我和我的团队一直致力于支持科研工作者，如果你需要更详细的实验方案，或者想要亲自体验这项技术，欢迎私信我"磁珠法"。让我们一起探讨，共同推动生命科学研究的进步!

卡卡

分子诊断是核酸的检测对象，主要用于各种疾病的临床实验室，如肿瘤、感染、遗传等。，而核酸 提取是分子诊断实验的“第一步”。几乎所有的实验都是基于核酸 提取。无论后续的克隆、PCR、q PCR、数据库构建、测序等。，需要核酸 提取才能顺利进行。核酸 提取的纯化质量是保证核酸检测数据准确性的前提，也是分子诊断产业发展的前提。今天边肖就给大家大致介绍一下核酸 提取在各个平台的应用以及相应的技术原理。
在PCR技术中的应用

根据核酸 提取方法可分为磁珠纯化法、硅胶膜离心柱方法和溶液型抽提方法三种。随着2020年新冠肺炎疫情的爆发，分子检测从曾经的王协颜飞入寻常百姓家，让越来越多的人知道了核酸 detection。Q PCR因其特异性强、灵敏度高而成为新冠肺炎核酸检测中应用最广泛的技术。q PCR实验操作中必不可少的步骤是核酸 提取。为了防控新冠肺炎疫情，核酸在各地大规模试验，磁珠法 核酸 提取因其速度快、浓度高而被广泛使用。


磁珠法 原理:超顺磁性纳米粒子表面经过纳米技术的改进和修饰(如硅基、氨基、羧基等)后，制备出超顺磁性二氧化硅纳米粒子。核酸与磁珠的结合主要依靠静电、疏水和氢键。在裂解物的作用下，RNA被释放出来。此时，磁珠与核酸分子“特异性结合”，形成“核酸—磁珠复合物”。在离液盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)的作用下。)和外磁场，复合物被分离。最后，用洗脱液洗去非特异性吸附的杂质，脱盐纯化，得到提取纯化核酸。近年来，随着自动化仪器的快速发展，基于磁珠法 原理的全自动核酸 提取仪器能够满足实验室大批量样品的需求，因此越来越多地应用于核酸检测。国内核酸 提取仪器品牌较多，如Xi安天龙、乐普医疗等。


磁珠法 提取 原理
除了磁珠纯化，硅胶膜离心柱 method和溶液型抽提 method可以用于核酸 提取。边肖提取 原理这两种方法适合你。


硅胶膜离心柱方法:主要用于微量核酸的分离纯化，利用裂解液促进细胞破碎释放核酸在细胞内。由于硅胶霉菌只对核酸有很强的亲和力和吸附作用，而不吸附蛋白质、多糖、脂类等其他生化成分，因此释放的核酸被特异性吸附在硅胶膜上，而其他成分在离心过程中被甩出柱外。最后用洗脱液洗脱硅胶膜吸附的核酸，得到纯化的核酸。这种方法不仅成本低，而且质量好。


溶液型抽提法:是最经典的提取法，几乎都是利用(SDS、CTAB、苯酚/氯仿)等有机溶剂和Tris、EDTA、NaCl等盐类的作用。除了提供合适的裂解环境外，还包括抑制裂解过程中样品中核酸 by 核酸酶的破坏(如EDTA)，保持核酸(如NaCl)的结构稳定性。有机溶剂使蛋白质变性，破坏膜结构，去除与核酸相连的蛋白质，使核酸在裂解体系中解离。因为苯酚、氯仿等。核酸为有毒易挥发试剂，回收率低，损耗大，工艺复杂，已逐渐被吸附柱法和磁珠法取代。


大多数PCR下游应用对核酸质量要求不高，但需要一个快速的提取进程，以缩短实验时间，提高实验效率。于是，市面上逐渐出现了各种核酸 fast 提取仪器，例如全自动核酸 提取净化器MolecisionMP-32可以在7分钟内完成16-32个样品的fast 提取。

第二代测序中的应用

在第二代测序技术平台的肿瘤基因检测项目中，不同的采样方式会产生不同的样本类型，通常是血液样本和组织样本(包括新鲜组织、福尔马林浸泡组织、石蜡包埋组织、石蜡线圈、石蜡切片等。).血液样本需要经过血浆分离步骤，只有在白细胞和血浆样本分离后才能核酸 提取进行。白细胞提取方法与血浆提取方法完全不同，因此需要不同的提取试剂盒。根据保存方法的不同，标本可分为福尔马林浸泡组织和石蜡包埋组织。


白细胞提取 原理:先破坏红细胞，利用红细胞和白细胞的膜结构差异，先将红细胞裂解，离心后收集白细胞。之后，膜蛋白和核蛋白变性，白细胞溶解并释放出游离DNA。通常，离子表面活性剂用于使蛋白质变性。然后，去除变性的蛋白质，将DNA留在上清液中。最后，DNA在高盐环境中从有机溶剂如无水乙醇中沉淀出来。


血浆提取 原理:血浆DNA又称循环DNA和游离DNA，是指血液中游离于细胞外的DNA。主要来源是白细胞解体释放的DNA，坏死组织特别是肿瘤组织释放到血液中的DNA，以及感染的病毒。对于样品较少的实验室，首选的核酸 提取方法是离心柱法。样品原理裂解后，游离DNA在高盐下与硅胶膜结合，然后在低盐高PH值下洗脱硅胶膜上的DNA。

新鲜组织提取 原理类似于白细胞提取 原理。只是预处理方法不同，组织提取需要消化。使用蛋白酶K和裂解物来消化组织并从组织细胞中释放DNA。为了达到良好的消化效果，实验室通常会通宵消化，从而获得高浓度的DNA。石蜡包埋组织的消化需要加入脱蜡剂脱蜡，然后组织消化，最后DNA 提取。

第三代测序中的应用

SMRT测序是第一个广泛应用的第三代测序技术，具有长阅读长度的特点。为了满足长阅读的要求，提取高分子量DNA非常重要。按照层析柱法和磁珠法，不容易获得高分子量DNA。电泳技术可用于微生物，以满足高分子量DNA的提取要求。


微生物超高分子量DNA 提取 原理:采用琼脂糖包埋法，在微生物细胞悬液中加入琼脂糖，裂解细胞，促进DNA释放。经过电泳洗脱、凝胶切割和回收，该方法提取的DNA分子量可达300kb以上，将为第三代测序提供重要支持。

在核酸检测中，提取和纯化是影响检测结果的重要因素，也是分子检测的重要环节。受新冠肺炎疫情影响，全球及国内市场对核酸 提取净化试剂盒的需求持续上升，行业未来仍有较大发展潜力。在核酸 提取净化试剂盒生产方面，前期国外公司占领国内市场，在新冠肺炎核酸检测市场需求的带动下，核酸 提取净化试剂行业加速国产化进程，国内品牌市场占比持续提升。目前核酸 in分子诊断的检测占据主要市场，生物芯片是未来的重要趋势。

感恩由您

一步法做了什么？看看过程就知道了！


当然，说到这个话题 不得不说到 最近的新冠检测，甚至8次才阳性，可见这个核酸提取的方法得改进了啊，新冠病毒太特殊~
前些日子业内舆论繁杂，诸如“检测4次，才发现核酸阳性”、“CT结果来做确诊，不要迷信核酸”等报道层出不穷。目前国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》已更新至“试行第五版”，仍然强调核酸检测作为确诊的唯一标准。所以希望大家全心投入到全民防控疫情的焦点上来，发现问题，优化防控策略，才能让疫情的拐点更快出现。
01目前新型冠状病毒核酸检测存在的问题
目前新型冠状病毒感染的疑似病例与确诊病例已逾6万例，核酸检测需求量与日俱增。另外，湖北省增加“临床诊断”分类，将疑似病例标准放宽，需要更多保质保量的核酸检测产品投入一线应用。国家审核批准的新型冠状病毒核酸检测产品大多采取的是“实时荧光RT-PCR检测”方法，RT-PCR需要核酸提取、扩增2个步骤完成，但目前市面上部分注册产品仅有扩增产品，没有核酸提取产品，缺乏系统的核酸检测方案，无法保证核酸检测的系统性、准确性及可靠性，也间接造成了核酸检测遭到社会公众质疑的尴尬局面。因此，当检测产品投入一线后，可能还需匹配不同厂家的核酸提取试剂，对抗疫工作的开展产生了一定影响。

02提取技术是系统性核酸检测方案的关键
目前大量的新型冠状病毒核酸检测试剂投入疫情一线，但是防控效率、检测效率却未有明显提升。在央视记者采访前线检验科工作人员的报道中，也指出目前核酸提取环节存在差异，影响了检测能力的提升。

除前期的样本采集、转运、灭活等处理，核酸检测产品在检测过程中主要分为2个步骤，即核酸提取、扩增检测。扩增检测部分主要取决于前步骤核酸提取的纯度，以及扩增仪器的性能，因此核酸检测产品本身的差异性关键在于“核酸提取”这一步。
核酸提取技术亦可分为2部分，<样本裂解>与<核酸纯化>，目前市面上常见的样本裂解技术有<物理加热裂解>、<蛋白酶K裂解>、<一步法核酸提取>，核酸纯化技术有<梯度离心法>、<硅胶模柱法>、<磁珠法>。因此对于核酸提取技术的不同，样本裂解及核酸纯化环节不尽相同，操作繁琐程度不同，提取效率、核酸的纯度亦会不同。而复杂的操作更易导致气溶胶污染，带来交叉感染的风险。因此，选择合适的提取技术，对当前疫情防控至关重要。





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03简便、快速、安全的核酸提取方案：
一步法RNA技术
“一步法RNA技术”不仅能提供完整的核酸提取+扩增方案，还提高了检测效率。提取技术分为“样本裂解”、“核酸纯化”2个步骤：

①　第一步，样本裂解。普通的样本裂解技术<物理加热裂解>、<蛋白酶K裂解>均需加热，导致气溶胶污染等一系列问题。“一步法RNA技术”使用<一步法核酸提取>技术，无须加热煮沸，简便，快速，经济。

②　第二步，核酸纯化。近年来体外诊断行业技术突飞猛进，从<梯度离心法>、<硅胶模柱法>，到<磁珠法>的进步，一步步减少了核酸丢失，简化步骤，并提高了核酸纯化的纯度及效率。“一步法RNA技术”由于第一步样本裂解的技术优势，可以完全省去此步骤，做到“免纯化”，搭载此提取技术的新型冠状病毒核酸检测试剂灵敏度可达200copies/ml；可用于快速筛查分流，对疑似病例实现快速检测快速报告，区分是否感染新型冠状病毒。请看操作视频：





04
精准、高效、安全的核酸提取方案：
常温磁珠法技术
对于检验工作人员来说，可能磁珠法更加深入人心。“常温磁珠法技术”同样是在不加热的前提下，相较于其他核酸提取技术更加简化了操作步骤，仅需一次洗涤，可降低气溶胶污染的风险，降低交叉感染的几率；未使用乙醇，无乙醇残留抑制下游PCR反应的风险；且纯度更高，灵敏度和准确度更高，可让搭载此提取技术的新型冠状病毒核酸检测试剂灵敏度更高。可用于精准指导抗病毒治疗，评估抗病毒治疗效果，判断治疗终点，为临床提供可靠的辅助诊断依据。





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05
系统性核酸检测解决方案
病毒核酸检测是一种从基因水平进行检测的方法，作为本次新型冠状病毒疫情抗战的“主力军”，相较于其他方法学，具有更高的特异性和灵敏性，成本低，便于实施。
此次搭载圣湘特色提取方法的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，提供了一套完整系统的抗疫核酸检测解决方案：
a. 可满足快速筛查分流、精准诊断、辅助诊疗、评估疗效等全面需求；
b. 相比于其他需要核酸纯化步骤的检测产品，将更具优势——不需煮沸，不需转管，操作简便，最大程度减少交叉感染的风险，保证医护人员的安全；
c. 并在保证提取效果、检测准确性的前提上进一步提升检测效率。

同花顺

核酸提取试剂厂商数不胜数。方法大体分硅胶膜离心柱法、离子交换柱法、硅基磁珠法、羧基磁珠法、一步离心法。离心柱法是之前使用最广的方法，适合单个样品操作；离子交换柱法尤其适合质粒的大规模生产，如基因治疗载体生产；磁珠法是此次疫情中使用的方法，适合快速大量提取样品；一步法适合快速精制样品。一步法成本最高，限制了它的普及和大量使用。其中的填柱原料本不是被一次性使用设计的，未来可能随着用量增加，成本会被显著降低。欢迎合作开发各类纯化试剂盒及其原料