一文读懂流式细胞术

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流式细胞技术(flow cytometry，FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术，可对细胞、微生物等小颗粒物质进行多参数的高速分析、分选。FCM可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有可定量、灵活、快速等特点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。
流式细胞仪结构
流式细胞仪包括分析型和分选型两种类型，分析型由液流系统、光路检测系统、检测分析系统组成，分选型由液流系统、光路检测系统、检测分析系统、分选系统组成。
液流系统：由鞘液流和样品流构成，鞘液流从鞘液桶开始，流过专门的管道进入喷嘴，经过喷嘴的小孔形成稳定的可见液流。



图1：流动室及液流系统

光路检测系统：包括激光、透镜和光学信号检测器。激光从激光器发出，照射到样品流中的细胞会产生散射光，如果细胞上结合有荧光素，若可以被激光激发，荧光素则会向四周发射荧光。散射光信号包括正对激光方向接收的前向角散射光（FSC）和与激光方向在同一个水平面并与激光成90°角的侧向角散射光（SSC），荧光信号与SSC接收方向相同。



图2：光学系统

分选系统：位于液流可见部分，是在喷嘴处多了一个高速振荡器，在分选过程中使用喷嘴高速振荡，带动从喷嘴流出的可见液流高速振荡，从而使可见液流在下段形成相互独立的液滴而不是连续的液流。



图3：分选系统

检测分析系统：主要是对各个通道收集到的光信号进行汇总分析，通过分析得到样品中所有细胞的理化特征，最后以各种图谱进行结果展示。
流式细胞术原理
✍ 分析型流式细胞仪检测原理
将待测样品制成单细胞悬液，在鞘液的包裹下进入流式细胞仪内的检测区域，细胞在激光的照射下会发生散射和折射，产生的散射光信号和荧光信号由不同的通道接收。其中前向角散射光（FSC）的强度与细胞直径成正相关，可以理解为细胞直径越大，FSC越强，细胞直径越小，FSC越弱。侧向角散射光（SSC）的强度与细胞内颗粒结构复杂程度成正相关，可以理解为细胞内颗粒结构越复杂，SSC越强，细胞内颗粒结构越简单，SSC越弱。而荧光信号的强度则与所待测细胞与荧光染料结合程度有关。
最后计算机分析系统会对接收的不同电信号进行分析处理，检测结果最后用单参数峰、双参数散点图、三维立体图等来表示。
✍分选型流式细胞仪检测原理
通过分析检测细胞，判断液滴是否需要被分选，然后再这些细胞液滴成为独立液滴前进行相应处理，使这些细胞液滴带上相应电量的电荷，这些带有电荷的独立液滴通过强电场时，则会产生偏移，然后进入到相应的收集管中，其中未被收集的液滴则会作为废液而被处理，从而实现流式分选。



图4：流式细胞分析

流式细胞术特点
速度快：对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，测量速度可达每秒数千甚至上万个细胞。
灵敏度高：每个细胞上只需带有1000~3000个荧光分子即能检测出来。
多参数：多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征
精度高：在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨率更高
纯度高：可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达到99%以上。
无害性：能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选。
流式细胞术应用
1. 细胞DNA含量检测：用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。
2.细胞表型分析：细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用流式细胞仪可对其进行检测分析，分析荧光细胞含量，也可分析阳性细胞CD分子的相对含量。
3.血小板功能分析与血小板病诊断：通过用荧光素标记的单克隆抗体结合流式细胞术，可以敏感、特异、快速的诊断血小板病。
4.红细胞疾病诊断：网织红细胞技术，用于贫血筛查。
5.细胞内蛋白分析：细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量分析，测出阳性细胞数量和这种蛋白的相对含量。
6.可溶性蛋白检测：用于检测可溶性蛋白的流式细胞技术，将待检蛋白吸附到微球上，与荧光探针结合，测定微球上这种蛋白的荧光强度，与已知微球荧光强度比较，求待测蛋白含量。
7.分选：用荧光探针标记的细胞，可被有效分离出来。

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