流式细胞仪的工作原理是怎么样的？

非诚勿扰孟非

流式细胞仪的工作原理是怎么样的？

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清风寡欲

流式细胞术实验是实验室常见的基础实验，涉及的知识复杂，影响结果的因素众多。
流式细胞仪（Flow cytometer）是一种可以快速、准确，并且能够检测快速直线流动状态的单个微粒（通常是细胞），进行自动分析和分选的设备。获得悬浮在液体中的单个细胞的物理和化学方面的特征参数，同时，可以根据预设参数范围把指定的细胞亚群分选出来。流式细胞术应用范围广泛，包括：细胞功能、细胞活性、细胞增殖、细胞凋亡、免疫表型分析、细胞因子检测、细胞内蛋白质检测、细胞周期等。
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大力水手

哈喽大噶好！我是X-Lab的熊小花，今天我将系统地为大家介绍一下流式细胞仪的原理，废话不多说，直接开始~
流式细胞仪一共有“液流室及液流驱动系统”、“激光光源及光束形成系统”、“光学系统”、“信号检测与存贮、显示、分析系统”以及“细胞分选”五个系统（图1&2），下面我将详细地分别为大家展开介绍。



图1&2.流式细胞仪内部基本构造

一、液流系统
流式细胞仪吸取细胞悬液后，细胞在气体的压力下进入流动室；而鞘液在高压下从鞘液管喷出，包裹着细胞高速流动形成鞘流，使细胞排成单列依次经过仪器的测量区（激光与液流垂直相交点）如下图：



图3 https://www.bilibili.com/video/av599308074/

二、 激光光源及光束形成系统
流式细胞仪大多采用氩离子气体激光器产生激光（波长488nm），在细胞经过测量区的时候，激光垂直照射被荧光染色的细胞，荧光染料被激发从而产生荧光信号和散射光信号。散射光信号分为前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC），FSC反映细胞的大小而SSC反映细胞内部的结构和颗粒性质，细胞内结构越复杂，SSC越强，如下图所示：死细胞的FSC值小，SSC值大。



图4.散射光信号https://zhuanlan.zhihu.com/p/377024443Flow cytometry: basic principles and applications[J]. Critical reviews in biotechnology, 2017, 37(2): 163-176

三、光学系统
当不同的荧光染料受到激光激发后会发射不同波长的荧光，这些荧光与SSC一起沿激光90°方向经过各种滤光片以到达对应的通道。
滤光片有长通、短通、带通滤光片。长通滤光片（LP）只允许特定波长以上的光通过，如LP500滤光片使500nm以上的光通过，驳回/吸收500nm以下的光；短通滤光片（SP）则与LP相反，它只允许特定波长以下的光通过；带通滤光片（BP）则可以允许一定波长范围内的光通过，如BP500/50，允许通过的波长范围为475~525nm。借助滤光片可以把不同波长的荧光信号送入到不同的电子检测器，如下图：



图5.流式细胞仪的光学系统

然而在激光的照射下，对细胞染色的荧光染料被激发发出特异性结合的荧光信号，细胞本身在激光照射下也会发射微弱的荧光，即本底荧光；除此之外，还会有非特异性结合的荧光信号出现。比如，偶联荧光素的抗体Fab段特异性识别细胞表面的标志蛋白与其特异性结合，但免疫细胞表面会有Fc受体，抗体的Fc段会与Fc受体非特异性结合产生假阳性结果，如下图：



图6. https://zhuanlan.zhihu.com/p/36382692

为了消除背景荧光（本底荧光+非特异性结合荧光），我们可以设置一些对照组:
设置空白对照：即未染色的细胞，以此排除样本自带的本底荧光；
设置同型对照组：即与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白（只有一小部分可变区不同，Fc段相同），排除细胞Fc受体造成的假阳性结果。
除此之外，我们还可以用与抗体同种属的血清封闭细胞上的Fc受体排除这种非特异性结合，还可以通过间接染色细胞来排除这种情况，即先用不带荧光的一抗孵育细胞，再用偶联荧光的二抗特异性识别一抗的Fc段，如下图：



图7.流式间接染色

四、信号检测与贮存、显示、分析系统
携带荧光染料的细胞经过测量区被激光照射发射光子，产生散射光和荧光信号到达对应的检测器后被采集分析。FSC信号会被沿激光方向的光电二极管检测到；而SSC、荧光信号沿着激光90°方向通过滤光片到达对应通道，由光电倍增管PMT检测。一旦光信号被检测到，它们就按比例转换成电子电压脉冲信号。每个脉冲信号的高度宽度及面积被分析后转为数码信号储存在计算机内，如下图：



图8.流式细胞仪信号检测与贮存、显示、分析系统

随着荧光标记的细胞逐渐通过激光束，检测到的电压强度会逐渐增强，下图可以看到随着时间变化所产生的一段电压脉冲。通过积分各时刻脉冲的高度值（H）可以得到脉冲面积(A)，相信用软件处理过流式数据的同学一定不陌生：一般情况下常用脉冲面积和脉冲高度来表示荧光强弱,而脉冲宽度（W）代表该细胞的大小，调高经过PMT的电压可以对整个信号进行放大。



图9.流式细胞仪随着时间变化所产生的一段电压脉冲 https://zhuanlan.zhihu.com/p/435782842?utm_id=0

在整个荧光信号发射到被检测的过程中，由于目前所用的各种荧光染料的发射谱范围都有一定的重叠，所以当细胞携带两种荧光染料(PE&FITC)时每个光电倍增管会检测到两种荧光，如FITC检测通道会检测到1%的PE荧光，这即是荧光溢出，通常人们会通过调节补偿减去进入检测器但其实不需要测定的荧光信号，这个时候就需要在实验的过程中设置单染对照了。
在此小花顺便附上流式常用的荧光染料：



图10.https://zhuanlan.zhihu.com/p/393229507

五、细胞分选系统
在做完流式分析后，我们还可以将指定细胞从细胞群分选出来。流动室喷口处有一超高频压电晶体，充电后震动，鞘流以一定速度从流动室喷口喷出震动断裂为均匀的单一液滴，液滴内包含待测细胞，给这些液滴加以不同的正负电荷，当它们经过几千伏的偏转板时，带电液滴在高压电场的作用下发生偏转从而落入不同的收容器中。
在细胞分选时，注意要使液滴下落均匀，断点位置恒定。这取决于分选速度与振荡频率，我们通过控制鞘液压力和喷嘴直径可以来平衡分选速度和振荡频率。分选速度过快的话会影响细胞活性；而喷嘴的选择取决于样本细胞的大小，喷嘴直径一般为细胞大小的5倍，若两边发现有液体呲出来就说明喷嘴过小，应更换大号喷嘴。
好了，流式细胞仪的原理就介绍到这里，相信看完之后下次做流式时你一定眼明心亮，那我们下期再见，记得点赞、转发、关注我们哦！
参考文献
[1] Adan A, Alizada G, Kiraz Y, et al. Flow cytometry: basic principles and applications[J]. Critical reviews in biotechnology, 2017, 37(2): 163-176.
[2] Ormerod M G, Imrie P R. Flow cytometry[M]. Humana Press, 1990.

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队长是我

流式细胞仪的工作原理：待测样品(如细胞、微球、精子或细菌等)被制成单细胞悬液，在一定压力下被鞘液包裹着形成单列的细胞进入流动室，并与激光束相交。细胞被激光激发后产生散射光和荧光，经光电转换器处理后变为电信号，在电脑上以数字信号的形式展现出来。

清风寡欲

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，在免疫学、细胞生物学、病毒学、癌症生物学和传染病监测中均有应用。
流式细胞仪（Flow Cytometer）是以流式细胞术为理论基础，集流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机为一体的一种新型高科技仪器。



流式细胞术操作流程
结构组成
流式细胞仪主要由流动室及液流系统、激光器及光学系统、光电管及检测系统、计算机及分析系统四个部分组成。



流式细胞仪原理示意图
待测细胞被制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后置于专用样品管中，在气体压力推动下被压入流动室，流动室内充满鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液），在高压作用下从鞘液管喷出包裹细胞，使细胞排成单列形成细胞液柱，依次通过检测区。液柱与高度聚焦的激光束垂直相交，被荧光染料染色的细胞受到激光激发产生荧光信号和散射光信号，这些光信号通过波长选择的滤光片，由相应的光电管和电子检测器接收并转换成电信号，经放大器放大后送入计算机并进行分析显示和结果输出，测定的结果常用单参数直方图、双参数散点图、轮廓（等高）图和三维立体图来表示。



流式图的类型
而带有细胞分选功能的流式细胞仪对细胞的分选是由分选器来完成。待分选的细胞在形成液滴时被充以特定的电荷，并通过超高频的压电晶体产生高频振荡，使液柱断裂成均匀的液滴，带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷发生偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。



流式分选示意图
应用范围
1.免疫学研究
免疫表型是流式细胞术中最常用的应用。它利用流式细胞术的独特能力来同时分析混合细胞群的多个参数。在最简单的形式中，免疫表型实验由用荧光染料偶联抗体染色的细胞组成，这些抗体靶向细胞表面的抗原。这些抗原中的大多数由人类白细胞分化研讨会给出“分化簇”编号或CD编号，以便使用通用命名法来定义针对特定细胞抗原的单克隆抗体。例如，CD3是用于定义存在于所有T细胞上的T细胞共受体，也就是T淋巴细胞，在T淋巴细胞分类中，根据表面标志和分化抗原的不同分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。



CD4+T细胞和CD8+T细胞的门控图
2.流式细胞术可用于鉴别死细胞和活细胞等。



鉴别死细胞与活细胞

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