带您认识流式细胞术中的各种图

风云

流式图有很多种，最常用的是流式直方图和流式散点图，还有流式等高线图。流式直方图只能显示一个通道的信息，流式散点图和流式等高线图可以同时显示2个通道的信息。
流式通道
　　流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道：散射光通道有两个，包括FSC通道和SSC通道，一般所有的流式细胞仪均有这2个散射光通道；不同型号的流式细胞仪其荧光通道的多少差异较大，有的甚至没有光通道。
　　FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。细胞体积越大，其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（granularity）。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
　　一般在硏究细胞样品时，首先关注的就是样品中细胞的FSC-SSC散点图，x轴代表FSC值，y轴代表SSC值，将细胞都显示于该散点图中，可以初步根据细胞的大小和颗粒度对细胞进行分群和分类。样品细胞不需要标记任何荧光素偶联抗体，直接上样分析就可以得到样品细胞的FSC值和SSC值，其值代表的是细胞的大小和颗粒度这两个基本的物理特征，所以样品的FSC-SSC散点图又称为样品细胞的 “物理图”。
　　荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，则需要标记荧光素偶联的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗体，其中的荧光素被相应的激光激发后产生荧光，该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收，就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子，以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光素越多，那么细胞表面表达的该CD分子就越多，因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD分子的相对数量。总之，荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱，从而反映细胞上结合的荧光素的量，进一步反映细胞上表达该CD分子的量，最后间接反映细胞表达某CD分子这一化学特征。
　　不同细胞群的FSC值和SSC值最多相差几倍，而荧光信号强弱之间一般相差很大，阴性细胞与阳性细胞之间、强阳性与弱阳性之间有时可以相差几十倍、几百倍，甚至几千倍，呈指数关系。所以，流式图数轴上FSC值和SsC值以“一般数序形式”表示，而荧光通道值常以“对数形式”（logarithmic scale）表示，在识图时需要注意数轴的表示形式。当然，并不是所有的荧光通道值都以“对数形式”表示，当荧光信号值相差不多时，也可以“一般数序形式”表示，如P染色检测细胞内DNA含量以及Hoechst33342染色分析和分选侧群干细胞时，均以“一般数序形式”表示。
流式直方图
　　流式直方图形成的原理与统计学中的直方图相似,是在统计学直方图的基础上进一步发展而成的。流式直方图的x轴表示一个通道的值,y轴表示细胞数量。



　　流式直方图虽不是如此简单，但是基本原理是相同的。流式直方图是在此统计直方图的基础上，使统计区间不断地缩小，缩小到甚至可以认为一个值就是一个统计区间，使统计的细胞数量不断地增加，增加到以万计，甚至以十万计时，相邻的小统计区间内的细胞数相差不多，这时的直方图好像是由光滑的曲线所围成的。其实，这只是直方图统计的细胞数达到一定量时视觉上的一个假象，这个由光滑的曲线围成的流式直方图实际上是由无数个非常小的统计区间组成的为了方便理解，可以认为x轴上的一个点就是一个统计区间，而曲线上该点对应的y轴值就是x轴代表的通道的荧光信号值对应的细胞数。这时，统计细胞群体比例时可以通过计算曲线下所围的面积的比例来表示。



　　综上所述，流式直方图本质上就是统计直方图，是累积显示细胞量非常大而统计区间又非常小的统计直方图。
流式散点图
　　流式直方图只能表示一个通道的信息，而流式散点图能够同时表示两个通道的信息。流式散点图也是采取坐标轴的方式，x轴表示一个通道的值，y轴表示另一个通道的值，图中每一点代表一个细胞，该点所对应的横坐标值就是该点所代表细胞的x轴通道的值，所对应的纵坐标值就是该点所代表细胞的y轴通道的值。
　　与流式直方图相比，流式散点图能够同时表示两个通道的值，能够更加直观地表示细胞的信息，所以流式散点图更加直观和常用。虽然，两张流式直方图也可以表示两个通道的信息，但是两张流式直方图不能表示细胞这两个通道值之间的相互关系，如不能直观地表示其中一个通道值低的细胞其另一个通道值是高还是低，而在流式散点图中却可以非常直观地发现细胞群体中这两个通道值的相互高低关系，从而更易于细胞分群、分类，以及确定比例关系等。
　　下图所示的是某正常人外周血白细胞FSC－SSC散点图。FSC代表细胞的大小，SSC代表细胞的颗粒度，从图中可以看出，根据细胞的大小和颗粒度，正常人外周血白细胞可以分为3群。进一步研究发现：小细胞、小颗粒度的红色细胞群是淋巴细胞群，T细胞、B细胞和NK细胞都位于此淋巴细胞群；中细胞、中颗粒度的绿色细胞群是单核细胞群大细胞、大颗粒度的黄色细胞群是中性粒细胞群。



　　一般在流式分析过程中，先利用FSC-SC物理图根据细胞的大小和顆粒度将细胞进行分群，然后根据目标细胞处于哪个群体，再将该群体细胞设门（setgate），进一步分析该群体中的目标细胞。
　　门（gate）是流式分析过程中一个较为重要的概念，流式分析时有时不希望所有的样品细胞都显示于流式图中，而是希望只显示感兴趣的细胞，排除其他非相关细胞的干扰，使显示的信息更加直观，更具有针对性。例如，分析CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例时，样品细胞是小鼠脾脏单个核细胞，此时可以根据CD4的表达情况，将CD4+T细胞设门显示于一个新的流式图中，则该流式图只显示所设门内的细胞，即只显示CD4+T细胞，其他无关细胞不会被显示。在相应散点图中x轴代表CD4信息，轴代表CD25信息，这样就可以非常直观地计算出调节性T细胞的比例。
　　下图所示的是正常C57小鼠的脾脏淋巴细胞分群的流式散点图。
　　图A是所有脾脏单个核细胞的FSC-SSC散点图，设门淋巴细胞群显示于图B和图D所示的散点图中。图B所示的是脾脏淋巴细胞的CD3-CD19散点图，从图中可以看出，脾脏淋巴细胞主要包括CD3+CD19-T淋巴细胞和CD3-CD19+B淋巴细胞两群细胞，分别占总淋巴细胞的36.4％和58.3％，牌脏中的B细胞要多于T细胞。图C所示的是将图B中的B细胞设门后显示的CD19-CD5散点图，CD5+B1 B细胞占所有脾脏B细胞的7.5％，说明小鼠脾脏中的B细胞绝大多数是经典的CD5-B2B细胞。图D所示的是脾脏淋巴细胞的CD3-NK1.1散点图，主要可以分为CD3+NK1.1-T细胞、CD3-NK1.1+NK细胞和CD3-NK1.1-B淋巴细胞，脾脏淋巴细胞中的NK细胞比例较低，只占3.5％。图E所示的是将图B中的T细胞设门后显示的CD4-CD8散点图，从图中可以看出，CD4+T细胞和CD8+T细胞分别占55.6％和40.2％，脾脏中的T细胞以CD4+T细胞为主。图F所示的是将图E中的CD4+T细胞设门后显示的CD4-CD25散点图，CD25+调节性T细胞占所有CD4T细胞的15.8％，说明在正常情况下牌脏中调节性T细胞的比例较低。
　　通过对以上流式散点图的分析，让我们对正常小鼠牌脏淋巴细胞分群有了大致的了解。从这个实例也可以看出，流式散点图比流式直方图显示更多的信息。



流式等高线图
　　流式等高线图与流式散点图相似，一张流式等高线图也能同时显示两个通道的信息，所不同的是，它借助地理等高线图的形式。地理等高线图用封闭的环线代表海拔高度相同的地方，环线聚集越多，表示海拔高度变化越快，环线的中央区域表示海拔最高或者最低的区域。流式等高线图借助地理等高线图表示细胞的密集程度，流式等高线图的环线代表的是细胞密度相同的区域，所以，环线聚集越多的地方表示此区域细胞密度变化越快，细胞最稀疏的地方还是用散点表示，环线的中央区域代表细胞聚集的中心。
　　流式等高线图的意义和实际应用与流式散点图较为相似，可以看作是流式散点图的一个变体。相比之下，流式散点图更为直观，所以应用也更为广泛。当然，流式等高线图也有其自身的优点，它较能直观地体现细胞群的集中点，等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点，一般代表一个细胞群，所以在某些情况下，流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。
　　下图显示的是正常C57小鼠脾脏淋巴细胞分群的流式等高线图。



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