细胞免疫荧光的结果怎么分析？

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细胞免疫荧光的结果怎么分析？
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清风寡欲

实验技能分享免疫荧光

免疫荧光（Immunofluorescence，IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一种强大的技术。它的原理是利用荧光标记的抗体作为探针对组织或细胞内的特定抗原进行定位和定性的分析。IF是一个很好的检测技术工具，用于研究感兴趣的产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移。
免疫荧光检测方法

直接免疫荧光：携带荧光素的抗体直接与抗原反应，形成抗原—荧光素标记抗体复合物。该法优点是较简单，特异性较高；缺点：应用范围较窄，敏感性也较低。




间接免疫荧光：先用特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合，形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物。（实验室最常用的方法）。




间接免疫荧光主要介绍

间接免疫荧光试验的主要步骤包括制备样品、固定、通透、封闭、以及一抗和二抗的孵育和最后的激光共聚焦拍照。

1.  细胞准备
将细胞接种于加有爬片的24孔板中，待细胞长到合适的密度进行样品的处理。密度太大，会造成细胞过于拥挤，形态不佳且边界不清，并且导致染色背景过深。如果细胞过少会导致细胞活性不佳，从而易发生非特异性染色，因此，染色时细胞密度最好在60%-70%左右。

2. 固定
使用4%的PFA室温固定30min。固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，目前4%甲醛较常用，适用于研究细胞膜蛋白。




3. 通透
固定结束后，用1×PBS洗三遍后，加入0.1%TritonX-100 100μL/片，室温通透10min。通透的目的是在细胞膜上打孔，让抗体进入细胞内于抗原结合。

4. 封闭
通透结束后，用1×PBS洗三遍，加入10% FBS PBS 100 μL/片进行封闭。封闭是为了放置内源性非特异性蛋白抗原结合。




5.  一抗孵育
将相应的一抗用10% FBS PBS以1：500稀释比例进行稀释，加入稀释好的一抗100μL/片。室温孵育1h。




6. 二抗孵育
1h结束后，用1×PBS洗三遍，将与一抗同种属的二抗用10% FBS PBS以1：500或1：1000的稀释比例进行稀释。加入稀释好的二抗100μL/片。室温孵育1h。




7. DAPI染核
二抗孵育结束后，用1×PBS洗三遍，加入DAPI100μL/片，室温染核10min。

8. 封片
封片：染核结束后用1×PBS洗三遍，然后用超纯水洗三遍，在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片弃干水后轻轻倒置放于载玻片上，室温避光干燥，-20℃保存。




9.利用激光共聚焦显微镜拍照
注意事项：
一抗必须来源于不同种属，且荧光标记二抗、一抗的种属要匹配，二抗不能有交叉反应；
从孵育二抗开始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果；
洗涤过程中，动作要轻柔，防止把细胞吹洗掉；
选择合适的细胞密度进行试验。

同花顺

一、免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。二、细胞免疫荧光

主要应用于细胞内抗原抗体检测，适用于细胞水平实验。

直接法
将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法（较为常用）
如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。

操作步骤（以检测细胞内病毒抗原为例）

• 倒出培养液。
  
• 润洗，将1ml SD完全培养基沿培养板缓慢打入，盖上盖子，轻柔摇晃，先使用1ml的枪沿侧壁吸出润洗后，再使用200ul的枪沿壁吸出残液。
  
• 吹打，加入2ml SD完全培养基，打在培养板底部，然后反复抽打，直至培养板底部由磨玻璃样变为透明。（吹打之后放置，后使用之前都要反复吹打）
  
• 将细胞爬片放入24孔板，每孔一个（注意每个孔只放一个，不要多放，注意检查）。
  
• 往（3）中吹打后的细胞液中继续加4ml的SD完全培养基（即总计6ml）。将细胞液分装到24孔板中（分装之前吹打，防止细胞沉降而造成的不均匀），每个板500ul。注意事项：每一步打开细胞培养时，防止细胞培养板盖时勿使细胞培养板盖朝上放置。
  
• 在将细胞培养板放于培养箱之前，请喷酒精。
  
• 细胞培养24小时之内使用，最好20小时。沿侧壁吸出培养液。1PBS润洗2次，沿侧壁打入1ml或500ul PBS，轻柔摇匀2-3次后，沿侧壁吸出。
  
• Pfu number/细胞数=pfuV/细胞数=感染复数 感染复数为2，加病毒20ul + 480ul SD培养液 感染复数为15，加病毒150ul + 480ul SD培养液 病毒滴数经提前测定为1*10-7pfu/ml
  
• 先加SD培养基再加病毒。（24h或48h之后进行（10））
  
• 固定细胞：吸出上清，加4%PFA（组织固定液），1ml/孔，室温下30min。
  
• PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。
  
• 细胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T为Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室温1h。
  
• 封闭：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween)  BSA 为牛血清白蛋白。1ml/孔，室温下2h。
  
• 一抗：用封闭液按1：100（比例依照抗体说明书）稀释，300ul/孔，4摄氏度过夜。
  
• PBST（Tween）洗3次，10min/次 。
  
• 二抗（4℃抗体荧光抗体）：用PBST（Tween）按1：1000稀释，300ul/孔，室温避光1h。
  
• PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室温避光10分钟。
  
• PBS 洗2次，1ml/孔，立马抽出。
  
• 载玻片上滴加封片液，细胞爬片的细胞层与封片液接触。
  
• 荧光共聚焦显微镜观察。
  

队长是我

免疫荧光可以通过不同的抗体结合不同的蛋白，通过选择不同的颜色的抗体来对目的蛋白进行定位，最后使用DAPI进行细胞核染色，染色完成后使用抗荧光衰减封片剂进行封片，或直接使用含DAPI的抗荧光衰减封片剂一步法染核封片。
利用荧光显微镜进行观察。在同一个视野下，使用不同的滤光片进行观察拍照。导出后使用PS或者image J软件进行merge。
DAPI标记细胞核，呈蓝色，因此可以根绝细胞核的位置，来判断其他蛋白的定位。

继续前进

免疫荧光（immunofluorescence）是一种常用的光学显微术，即用荧光显微镜来观察细胞中的特定生物分子。免疫荧光依赖于抗体抗原的特异性结合，然后通过直接标记或间接标记方法使用荧光分子指征抗体-抗原结合的位置，以确定目标生物分子在细胞中的位置、丰度和分布情况。

免疫荧光实验流程




1. 固定
固定液种类：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。

2. 透化
通透的目的是使抗体进入胞内。0.5% Triton X-100 室温通透20 min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。

3. 封闭
封闭可减少一抗和二抗与非特异性位点结合。通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。

4. 一抗孵育
根据一抗说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST， 在摇床上缓慢摇动洗涤5 min，共洗涤3次。

5. 荧光二抗孵育
用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5 min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。

6. 复染核（定位的关键）
在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI。

7. 封片
用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。

免疫荧光常见问题
一、荧光信号弱怎么办？
从样本本身、固定透化到抗体孵育，甚至是拍照，每一步都有可能是原因。

1. 样品质量
选用新鲜制备的样本以及适当的保持条件。

2. 靶标丰度低

• 适当提高一抗浓度。
  
• 选择荧光强度更强的二抗，比如Alexa Fluor系列二抗。
  

3. 固定方法不当

• 甲醛和蛋白的氨基通过共价键结合，可能会遮盖抗原表位，导致靶表位信号减弱。建议调整抗原修复方法或固定方法。
  
• 多聚甲醛会与GFP荧光蛋白发生醛化反应，导致信号减弱。
  
• 检测膜蛋白一般不建议使用甲醇或丙酮固定，有机溶剂能够破坏膜结构。
  

4. 透化方法不当

• 检查靶标蛋白表达位置，胞内蛋白需要透化处理。
  
• 膜蛋白需要考虑所检测靶表位位于膜内还是膜外，膜外则不需要透化。
  

5. 二抗选择不当
二抗选择建议如下：




6. 信号放大不够
如果检测靶点是低丰度蛋白．信号弱可能是由于信号放大不足导致的，可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信号放大技术，进一步增强信号，实现低丰度，难以检测蛋白的检测。

7. 光漂白

• 减少照明强度/时间。
  
• 选用抗荧光淬灭封片剂。
  

二、背景太高了怎么办？

大家在操作时可以通过设置对照，帮助我们迅速判断背景的来源。对照包括自发荧光对照（无一抗、二抗）和无一抗对照。

1. 封闭不足

• 选用二抗种属来源的血清封闭。
  
• 选用链霉亲和素/生物素系统，需要用链霉亲和素封闭内源的生物链酶。
  
• 选用HRP系统，需要使用过氧化氢等商业化试剂盒去活化内源性HRP。
  
• 选用AP系统，需要使用左旋咪唑等商业化试剂去活化内源性磷酸酶。
  

2. 一抗
一抗浓度过高，减少用量

3. 二抗

• 设置无一抗对照，帮助确认背景是否来源二抗。
  
• 二抗浓度过高，减少用量。
  
• 抗体凝聚，使用二抗前离心去掉抗体凝聚物。
  
• 使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗，信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。
  

4. 自发荧光

• 设置自发荧光对照，确定是否自发荧光。
  
• 固定剂如醛类和氨基共价结合导致的自发荧光，可用硼氢化钠去除。
  
• 增加固定剂的漂洗次数。
  
• 避开背景高的波段，选用背景较低的波段检测。
  

感恩由您

抗体是证明抗原存在和对其进行亚细胞定位的重要工具。细胞染色是一种非常通用的技术。如果抗原被高度定位，则细胞染色可在细胞中检测到少至  1000  个抗原分子。在一些情况下，细胞染色也可用于通过图像分析仪等工具确定抗原的近似浓度。细胞染色可分为四个步骤：细胞制备、固定、抗体孵育和评估。更多内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn
试剂和设备

• 在盖玻片上培养的细胞
  
• PBS：0.01M 磷酸盐缓冲液，pH 7.2-7.4（P3813 或 P4417）
  
  
  • 甲醇，在 -20°C 冷却至少 1 小时（货号 32213）
    
  • 丙酮，在 -20°C 冷却至少 1 小时（货号 24201）
    
  
  

或

• 3-4％ 多聚甲醛的 PBS 溶液（货号 P6148）。用 5N NaOH 溶解并溶于 PBS
  
• 0.5％ Triton X-100 PBS 溶液（货号 T9284）
  

或

• 3-4％ 多聚甲醛的 PBS 溶液（货号 P6148）。用 5N NaOH 溶解并溶于 PBS
  
• 甲醇，在 -20°C 冷却至少 1 小时（货号 32213）
  

或

• PEM 缓冲液：0.1M PIPES（货号 P8203），5 mM EGTA（货号 E4378），2mM MgCl2 · 6H2O（货号 M0250）。使用 NaOH 溶液将 pH 调至 6.8
  
• 乙醇，在 -20°C 冷却至少 1 小时（货号 270741）
  

• 一抗
  
• 抗体对照
  
• 荧光染料标记的二抗
  
• 水性封固剂
  
• 显微镜载玻片（76 x 25 mm，货号 S8902）
  
• 荧光显微镜，配备合适的荧光检测滤光片
  
• 倒置光学显微镜（例如 Nikon TMS）
  

注意：

• 作为通用实验方案提供。一抗和二抗的最佳稀释度、细胞制备、对照以及孵育时间将需要根据经验确定，可能需要大量滴定。理想情况下，应使用产品数据表中推荐的一抗。还应包括适当的阴性对照和阳性对照。
  
• 请参阅相应的 SDS 安全处理所需的化学品。
  
• 对荧光偶联物和标记载玻片遮光保护。在黑暗中孵育样本，并尽可能遮盖。
  

细胞制备

• 从培养箱中取出细胞。在倒置光学显微镜下检查以验证所需的外观。弃去培养基。
  
• 用 PBS 冲洗；去除多余的溶液。
  

固定
固定细胞：
本文描述了四种不同的固定方法。根据应用（或产品数据表建议）选择合适的固定方法。
甲醇丙酮固定

• 在–20°C 下，在冷却的甲醇中固定 10 分钟。
  
• 去除多余的甲醇。
  
• 在–20°C 下，用冷却的丙酮透化 1 分钟。
  

或
多聚甲醛-Triton 固定

• 用 3-4% 多聚甲醛固定 10-20 分钟。
  
• 用 PBS 短暂冲洗。
  
• 用 0.5％Triton X-100 透化 2-10 分钟。
  

或...

一抗孵育

• 将一抗在 PBS 中稀释到适当的稀释度。在细胞上盖上盖子，在室温下孵育 60 分钟（建议使用加湿室）。
  
• 用 PBS 洗涤 3 次（每次至少 5 分钟）。
  

二抗孵育
注意：二抗仅适用于间接测定。

• 将标记的二抗在 PBS 中稀释到适当的稀释度。涂覆在盖玻片上并在室温下孵育 30 分钟。
  
• 用 PBS 洗涤 3 次（每次至少 5 分钟）。
  
• 去除多余的 PBS。
  

评估

• 用封固剂封固盖玻片并翻转到载玻片上。
  
• 在显微镜下检查。
  
• 记录结果。建议拍摄标记的细胞。
  

注意：建议进行适当的阴性对照。阴性对照产生一抗和二抗的背景荧光和非特异性染色。理想的阴性对照试剂是荧光染料缀合的小鼠单克隆或骨髓瘤蛋白。它应该是同种型匹配的，对被研究物种的细胞没有特异性，并且与测试抗体具有相同的浓度。自发荧光或阴性对照试剂荧光的程度将随所研究细胞的类型和所用仪器的灵敏度而变化。对于具有  Fc 受体的细胞进行荧光分析，必须使用同种型匹配的阴性对照。