请问：有哪些前沿的疾病分子诊断技术？

营养师

生物科学，人医，动物医学，

原文地址：https://www.zhihu.com/question/264067052

大力水手

核酸扩增技术（Nucleic acid amplification technologies, NAAT）既是分子诊断的基石，也是最大的瓶颈，它使得能够进行敏感而特异的传染病检测，这些检测也往往复杂且昂贵。
一大波的新方法正在加速商业化，包括一些在护理点（point-of-care, POC）和家庭环境中检测病原体DNA或RNA的无扩增（amplification-free）方法。




无扩增分子方法通常将听起来奇特的捕获组件（如DNA折纸、aptamers适配体、gold nanodimples金纳米凹坑或CRISPR）与尖端的检测技术（如量子点、石墨烯场效应晶体管（FET）、表面等离子体共振、纳米孔等）结合搭配使用。
在过去的几年里，一些初创公司首次提出使用这些组件技术进行快速、廉价的分子诊断测试，并经大流行时期的科学和生产创新加速，以支持更便宜和去中心化的测试。
然而，临床试验和监管许可的“死亡谷”仍然是开发和采用这些临床护理检测的巨大障碍。尽管核心技术令人兴奋，但具有无扩增分子诊断测试的初创公司可能会面临监管机构，特别是美国FDA的挑战，因为目前没有明显的已获批可用于对照等价的器械（predicate devices）。他们还可能面临来自护理点和家庭分子诊断方面老牌参与者的竞争，其中一些机构自己也在努力寻找利基市场。
甚至将无扩增分子诊断作为一个特殊类别来讨论也有点棘手，因为它们往往通过最广泛的术语被描述为它们不是什么，如使用非NAAT、非PCR或非扩增等术语。
此外，其中一些方法还可以检测其他生物标志物，如蛋白质，因此将它们归类为分子诊断甚至可能不太合适。
加州大学圣克鲁斯分校电气工程和光电子学教授Holger Schmidt建议，称它们为“单分子”技术则可以体现其靶标多变性的潜力。
他建议，用读出方法（例如，电学或光学）来合并这些单分子、无扩增的方法，也可能是大规模描述这些新技术的有效方法。
Schmidt与杨百翰大学和伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（UIUC）的长期合作者一起，开发了一种使用基于微珠的靶标捕获、光学诱捕和纳米孔读出来检测核酸以及蛋白质和其他分子的方法。这种方法最近被用来成功跟踪实验室中灵长类动物体液中的病毒负荷。
Schmidt在2017年共同创立了一家名为Fluxus的初创公司，以帮助将这项技术推向市场。该公司现在是Fujirebio的子公司，仍在进行早期开发工作，以解决可制造性和市场准备问题，但如何将该技术纳入未来的商业产品仍有待确定。
在另一个从实验台到病床的项目中，生物工程师Brian Cunningham和他在UIUC的团队一直在将生物传感显微镜与量子点、金纳米颗粒和等离子体荧光团等纳米颗粒标签相结合。
Cunningham说，该团队使用光子晶体表面来放大检测，因此单个标签可以通过包含网络摄像头质量图像传感器和廉价光源（如红色LED灯）的便宜仪器进行检测。
Cunningham的小组一直在使用替代的分子生物学方法，而不是PCR，包括“核酸链置换反应(nucleic acid strand displacement reactions)，这些反应对其靶标极其特异，不受抑制剂的影响，在室温下工作，也不需要酶。”
Cunningham说，该团队也在开发利用CRISPR-Cas的在无扩增方法，以及回收靶标分子以生成更多纳米颗粒进行计数的检测。从这个意义上说，这种方法是一种非指数却更线性的放大形式，因此不倾向产生虚假失控的扩增。他说，样本到答案的方法在10分钟内产生结果，在室温下检测极限约为1个attomolar。
Cunningham去年还共同创立了一家初创公司Atzeyo Biosensors，将其中一些检测和仪器商业化。
篡夺NAAT？
大多数已知的无扩增初创公司都针对护理点和家庭市场。家庭检测似乎对成本特别敏感，因此，假设无扩增方法的生产成本低于基于等温扩增的测试和仪器，它们可能就会有优势。
在新冠肺炎大流行期间推出护理点和手持核酸扩增系统以及传染病诊断的众多公司都致力于扩大和多样化测试菜单，但其中一些现在正在裁剪。
哥伦比亚大学拥有护理点测试专业知识的研究员Sam Sia说，疫情为技术开发成有效的“样本到结果”诊断测试提供了更多基础，但仍处于早期开发阶段。
从他的角度来看，Sia偏爱PCR，他共同创立的一家公司RoverDx正在开发全光学护理点PCR。
他认为无扩增方法的挑战仍然是低检测限。
他说，正因为如此，大多数方法仍然需要预扩增步骤。他补充说，尽管有些人提议绕过扩增步骤，但它们是否能达到承诺的检测限仍是一项正在进行的工作。目前，即使经历了许多挑战，PCR仍然是金标准。
因此，尽管有时被吹捧为PCR和等温扩增的替代方案，但对无扩增分子诊断的更温和的评估可能是，只有某些用例可能会从这些方法中受益。
基于CRISPR的诊断公司Intelligenome的首席执行官Wilson Zhang表示，他所知道的无扩增技术似乎都比其他技术更令人兴奋，或者更有可能在短期内进行商业开发。然而，他说，美国FDA批准的两种阿尔茨海默氏病疗法导致Quanterix等公司使用血液样本而不是脑脊液开发直接诊断测试，为此，“单分子检测技术非常棒”，因为它可以检测到低至飞克每毫升的水平。
Wilson说，如果分析和临床数据支持，无扩增技术可能会取代PCR或等温扩增。然而，“这些技术必须很好地满足市场中未满足的需求，并且只有在成本低、周转时间快且测试易于进行时才被接受。”
也就是说，篡夺PCR的无扩增方法对UCSC的施密特来说并不完全是科幻小说的内容。
他说，这当然是可能的，因为越来越多的方法正在达到PCR的灵敏度（如检测极限），或者至少能够检测所有相关浓度，同时消除额外的处理步骤。
加速
Schmidt指出，设备制造和小型化、包括CRISPR、光子学以及基于纳米孔、石墨烯和FET的电感测机制等检测化学的创新，都在推动该领域的进展。
许多支撑无扩增诊断的技术并不非常新，但科学似乎正在加速。例如，粗略地搜索美国国立卫生研究院基金数据库的无扩展诊断结果显示，过去四年半有148个受资助项目，再之前五年有77个项目，而2014年至2010年有51个项目。目前，美国国立卫生研究院资助的28个“无扩增”项目正在运行。此外，快速搜索“无扩增”一词的PubMed结果在2020年显示了43个结果，而在2023年攀升到了107个。
即使是一些旧的方法，最近也看到了令人兴奋的新发展。例如，研究人员最近使用一种称为lettuce的荧光DNA aptamer直接检测到SARS-CoV-2的RNA，它可以激活类似于绿色荧光蛋白的分子。
同样，根据最近对病毒检测的综述，使用等离子共振或表面增强拉曼光谱光学方法的平台已经开发了几十年，但新方法如使用内含金纳米颗粒的纳米凹坑nanodimples，可能有助于通过实现大规模制造来推动这些技术进展。
相比之下，UIUC的Cunningham指出，PCR、ELISA、数字PCR和Simoa等标准方法“由于使用一些酶、热循环、精确温度控制的组合”和其他固有功能，都存在局限性。
等温方法，如环介导等温扩增（LAMP），在引物设计和假阳性扩增方面存在问题，目前还不清楚其他等温NAAT方法——如重组酶聚合酶扩增（RPA）、解旋酶依赖性扩增（HDA）、指数扩增反应（EXPAR）或基于核酸序列扩增等——能获得多少商业牵引。
尽管存在这些挑战，但使用扩增的分子技术目前仍然是大多数诊断开发人员的最佳选择。
Cunningham指出，虽然SPR、纳米电传感器、声学传感器和波导等传统的无标签生物传感器都可以在没有酶的情况下进行直接检测，但其检测限值仍然高出一个数量级，无法与PCR和数字PCR竞争。
由石墨烯驱动
对基于石墨烯的方法的最近一篇综述指出，它们可以通过生物受体增强，并与FET和电化学生物传感器等材料相结合，以电流或电压变化的形式提供信号，或与表面等离子体共振等读取相结合，通过SPR角度的变化来提供信号。
根据对石墨烯上自组装生物分子的综述，基于石墨烯的生物传感检测传染病的潜力是巨大的，将这一概念转化为临床应用将是革命性的。
最近石墨烯（单个碳原子的六角形排列）的制造进展支持了电子检测技术的加速普及。
石墨烯的合成现在更加先进，卷对卷制造等创新使开发人员能够以比之前研究级石墨烯设备或依赖硅的设备低得多的成本购买大片材并制造高可复制的传感器。
这些新的石墨烯方法支持无扩增分子和单分子测试领域的一些初创企业。
例如，一家名为Flexotronix的公司开发了使用导电油墨和专有侧向流（lateral flow）格式的印刷电子产品的高速卷对卷生产线，部分资金由比尔和梅林达·盖茨基金会资助。据称，该生产线每年有能力进行多达50亿次基于生物传感器的测试。
去年6月，Flexotronix与GrapheneDx和Sapphiros合作，为POC和消费者设置开发了基于石墨烯生物传感器的诊断测试。1月，OraSure向Sapphiros投资了3000万美元，并达成了这些诊断测试的独家分销协议，当时指出，这些产品在未来有可能采用分子技术。
石墨烯和其他基底可以用不同的分子进行功能化，以创建生物传感器或生物分子传感器。
Cunningham的公司Atzeyo Biosensors使用一种生物传感器方法，可以通过金纳米技术和一种称为光子共振吸收显微镜的方法检测DNA、RNA和蛋白质生物标志物。这种方法需要最小的样本制备，可以多路复用（multiplexed），并产生记录的图像，以实现定性和定量结果。
与此同时，总部位于爱尔兰的Altratech将肽核酸或称PNA技术与珠子和互补金属氧化物半导体（CMOS）相结合，以测量电容进行直接分子测试。该公司之前表示，其目标是读出设备价格低于30美元，每次测试价格低于5美元，这暗示了这种方法的低成本。
而且，当双链DNA探针系带的微米大小的珠子在目标病原体存在下发生位移时，Scanogen的单分子系带（SMOLT）方法会产生信号，使用低倍放大镜头和低成本数码相机就可以检测这种位移。这家总部位于巴尔的摩的公司一直在开发这种直接从血中检测败血症的方法。
其他公司，如IdentifySensors Biologics和Cardea Bio，也正在将新大规模生产石墨烯的电子特性与其易于功能化的能力相结合。由此产生的生物传感器可以捕获病原体核酸，并产生高灵敏度的直接电读数。
推动新初创企业的另一种电子技术是表面等离子体共振。Nicoya Lifesciences等初创公司使用这项技术分析蛋白质，但据报道，这种方法也可以与核酸和其他分子兼容。
而且，碳的另一种用途是制造碳纤维微电极。这些可以与快速扫描循环伏安法（fast-scan cyclic voltammetry）相结合，以创造一种可能用于诊断的技术。类似的微电极方法是2009年无扩增诊断初创公司Xagenic的核心技术之一，其中一些技术最终被General Atomics收购。
生物传感器的非分子诊断用途也比比皆是。例如，Avails Medical部署了功能化生物传感器，用于抗菌素敏感性表型测试。Affinity Biosensors使用它们进行菌血症测试，而Diagmetrics使用它们进行基于呼吸的测试，GRIP Molecular使用它们来检测抗原、抗体、酶、激素、肽甚至小分子。事实上，这个行业似乎正在蓬勃发展，其他一些初创公司将用于诊断的生物传感器商业化，包括Glympse Bio、Hawkeye Bio、Nutromics和Nanopath。
关注CRISPR
即将出现的CRISPR方法也可能消除分子诊断中扩增的需要。
Cardea Bio使用基于CRISPR-Cas9的生物传感器诊断设备，该设备使用石墨烯晶体管分析其原生状态的DNA，无需扩增、标记或光学仪器。
莱斯大学和康涅狄格大学的一个研究团队创建了一个基于Cas13a的“超灵敏”的新冠病毒分子诊断，去年Lab on a Chip发表的研究描述了一个25分钟的无扩增微流体芯片的SARS-CoV-2测试，检测极限为10个attomolar。
而且，本月早些时候的一项研究表明，一种名为自催化Cas12a环状DNA扩增反应（AutoCAR）的方法可以应用于核酸诊断，可在室温下检测每微升中约1个DNA的副本，而无需额外的信号扩增。
为了缓和这一点，2022年的一篇Lab on a Chip综述指出，无扩增的CRISPR方法在标准化、多路复用、创建集成平台和保持低成本方面仍然面临挑战。
据Sherlock Biosciences首席执行官Bryan Dechairo称，Sherlock在开发中的所有分子诊断都需要某种类型的核酸扩增。Sherlock的新冠肺炎测试获得了FDA的紧急使用授权，使用了LAMP，但该公司也在开发一种专有的室温扩展技术，用于手持设备。
根据Dechairo的说法，基于CRISPR的人类分子诊断方法需要核酸扩增，以达到监管审批所需的临床灵敏性水平，特别是对于阴道基质等样本类型。
在过去的两年里，基于CRISPR的诊断领域也出现了一些新进入者，到目前为止，他们都在工作流程中使用了扩增。
例如，初创公司VedaBio正在开发一种方法，该方法使用专有的工程化改造复合物，它称为CRISPR-Cas核糖核蛋白或RNPs，来检测感兴趣的核酸，并随后放大信号。
凭借基于杜兰大学研究的核心技术，新来者Intelligenome正在开发基于血液的支原体结核检测。据这家初创公司的网站称，该公司的“管中实验室”测试包含高保真DNA聚合酶、带有集成双链稳定蛋白的PCR缓冲液、dNTP和核结核糖核酸扩增的DNA序列引物对。然后，它添加了Cas酶和与荧光探针和gRNA混合的反应缓冲液，并使用试纸条通过便携式荧光阅读器准确识别结核分枝杆菌。
然而，据哥伦比亚大学的Sia称，尽管人们对无扩增检测感到兴奋，“CRISPR工作虽然为诊断带来了希望，但却得到了过多的关注，特别是来自诊断领域以外的关注。”
潜在的障碍
到目前为止，这些新技术都没有得到美国FDA的评估，如果没有一个predicate device，监管许可的路径将经历更具挑战性的上市前批准（PMA）途径。
然而，这些测试的一些组件技术被纳入了一些FDA紧急使用授权的IVD产品中。
例如，Sherlock Biosciences的新冠病毒测试是有史以来第一个由FDA审查的基于CRISPR的居家检测。同样，在RADx的支持下，Ellume获得了EUA，使用量子点来增强免疫测定的检测。正如国家生物医学成像和生物工程研究所所长Bruce Tromburg之前所说，在疫情爆发之前，这种尖端方法可以被监管批准用于居家检测是难以想象的。
现在，Ellume作为针对视障人士的居家检测得到了联邦支持，Ellume也是一种创新技术的典型，这种的采用率增加在一定程度上受到患者倡导的启发，这可能对无扩增的初创企业都有用。
这些初创公司确实共享了一些FDA批准的技术，这也可以作为监管机构的参考点。
Thermo Fisher的Quantigene Plex是一种杂交微阵列，其中靶标核酸序列的结合会引发荧光信号而不是mRNA的扩增。Roche Diagnostics Eplex可能是商业上最先进的生物传感系统，尽管其生物传感和电子检测也需要放大。
就Atzeyo Biosensors的技术而言，Cunningham表示，一种可比的方法可能是NanoString Technologies（现在是Bruker的一部分），该公司使用非扩增的方式，检测与荧光标记的DNA条形码配对进行计数和可视化。
然而，“与我们相比，NanoString有一个相当复杂的工作流程和昂贵的检测仪器，这本质上是一个共聚焦荧光显微镜，”他说。
这个领域的竞争也在加剧。在疫情期间，许多公司推出了护理点和手持式核酸扩增系统以及其他传染病诊断，其中许多公司现在正在努力扩大测试菜单并使其多样化。
最近，一些来自大型参与者的快速POC分子系统已经启动或披露——包括BioMérieux的SpotFire、QuidelOrtho的Savanna、Becton Dickinson的Elience或Bio-Rad Laboratories的PCR One——这些也可能为直接检测方法提供竞争。
在当前的家庭诊断市场中，总的来说，公司正面临着一条艰难的报销之路。
EUA非处方分子测试的命运，所有这些测试都使用LAMP，也说明了这一领域的挑战。最近推出的Aptitude Medical Metrix设备集成了微流电化学传感器，是今年早些时候与Sekisui达成的独家美国分销协议的主题。3EO健康测试是去年600万美元RADxaward的主题，而Lucira健康测试则被辉瑞在破产诉讼中收购。
然而，其他三家快速分子系统制造商通过首次公开募股上市，然后股价迅速暴跌。尽管系统以经过审查和验证的LAMP技术为基础，但仪器和检测的成本以及其他业务问题导致Talis Biomedical在遇到制造问题后进入战略审查过程，LumiraDx将退市，Cue Health关闭。
更广泛地说，直接传染病测试的新兴方法也可能影响无扩增的MDx初创公司。Oxford Nanopore最近宣布，它正在开发一种基于测序的耐药结核病测试，预计将与BioMérieux合作推出该检测。基于纳米孔的方法最近也显示了ICU快速呼吸道感染测试的希望，并由初创公司Omixon和GenDx用于移植药物应用的HLA类型。
Schmidt说，尽管如此，检测其他生物标志物类型，特别是蛋白质的潜力是一些无扩增方法相比PCR的明显优势，也可能优于基于测序的方法。
尽管如此，他同意，对大体量临床实验室有好处的技术方法可能不适合快速测试、护理点测试或研究用的仪器。
Schmidt说，根据用例，需要有不同的最佳解决方案。

原文链接：https://www.genomeweb.com/molecular-diagnostics/momentum-builds-amplification-free-molecular-diagnostics-significant-hurdles
链接综述：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9145856/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10046683/
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/cs/d2cs00594h
https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2023/LC/D3LC00372H

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分子诊断(molecular diagnosis)是指使用分子生物学方法，诊断患者遗传物质结构和表达水平变化的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、拷贝数的多少及表达功能是否异常，以确定患者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。按照技术原理，可以将上市分子诊断技术大致划分为PCR技术、分子杂交、基因测序、核酸质谱、生物芯片5大类。

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