展望 | 用于传染病诊断的侧向层析

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作者：Hans R Boehringer, Brendan J O’Farrell
来源：Clinical Chemistry, Volume 68, Issue 1, January 2022, Pages 52–58,
网址：https://doi.org/10.1093/clinchem/hvab194

横向流动分析原理

传统设计的侧向流动分析 (LFA) 由多种材料组成，每种材料都有一个或多个目的。这些组件使用压敏粘合剂安装在背板上。有许多出版物描述了 LFA 条带的基本组件、架构和功能，包括 Brown和 O'Farrell。





通常，为了进行 LFA 测试，将样品添加到试纸的近端，其中“样品垫”支持样品处理，使其与其他测试元件兼容。处理后的样品然后迁移到“标记垫”上，该“标记垫”包含固定的缀合物，通常由与抗体或抗原缀合的纳米颗粒（例如，胶体金、有色或荧光胶乳、有色纤维素）制成。当样品再水化干燥的偶联物并移动时，样品中的分析物会与偶联物相互作用，因为两者都会迁移到试纸条的下一部分，即反应基质。通常，反应基质是多孔硝酸纤维素膜，测定的其他生物组分已固定在其上。这些通常是蛋白质，抗体或抗原，已在膜上以条带形式分配和干燥，用于捕获分析物和结合物。任何多余的试剂都会通过捕获线并积聚在吸收垫中。结果在硝酸纤维素膜上被解释为是否存在捕获的偶联物线，通过肉眼或使用阅读器来解释。

对最终用户有价值必须为决策者提供准确的信息。为诊断技术提供准确信息的范围包括从需要基础设施和集中实验室的高精度方法到可用于分散环境、护理点甚至家庭环境的不太准确的技术。

LFA 与后一种环境相关联；该技术被认为是解决简单问题的廉价解决方案。试剂、材料和制造工艺的最新进展提高了 LFA 在需要更高准确度和灵敏度的应用中的性能，同时保持了基本技术的优势。

这些进步导致 LFA 在分散测试环境、医疗和其他方面的应用得到改进。发达国家的应用程序已利用改进的性能来生成与复杂的基于实验室的格式相同的 LFA 性能。这些高性能分析使用横向流动条带与专门的阅读器、样品处理设备和具有板载功能的墨盒相结合 - 本质上是基于横向流动格式创建实验室分析仪。

许多其他侧流应用介于两个极端之间，要求高性能和易用性，再加上高端现场应用的移动技术。简而言之，LFA 曾经是实验室测试的相对较差的亲戚，现已发展成为一种多功能技术，能够在诊断连续体的所有点上都具有足够的性能。由于这些改进已集成到 LFA 中。

通过材料、试剂、制造设备和工艺技术的不断改进以及下一代辅助技术。直接影响 LFA 性能的灵敏度和特异性的关键成分包括识别试剂，通常是最常用的抗体，以及适配体或亲和体。虽然难以预测 LFA 中的试剂性能，但亲和常数是除特异性之外的主要定义参数。

由于目标抗原和捕获试剂之间的相互作用仅限于几秒钟，因此高结合率是一个重要特征。抗体和抗原之间的相互作用很快发生，尽管混合时间可能持续几分钟。高亲和力抗体通常提供更好的结果，因为它们的亲和力常数可以在皮摩尔范围内，而适配体在纳摩尔范围内，至少弱 1 或 2 个数量级。

可以设计重组或基因工程抗体以实现皮摩尔或更好的亲和力，从而产生接近扩增核酸测试水平的 LFA 敏感性。有充分证据表明，抗体工程方法将提高治疗和诊断应用的亲和力。Boder 和他的同事报告了针对荧光素的抗体，这些抗体被设计为具有飞摩尔亲和力 ，比原始抗体克隆提高了 10000 倍；其他人报告了对类固醇和癌胚抗原抗体的亲和力的提高。

与基于胶体金的测定相比，LFA 的其他成分导致灵敏度大幅提高（10-100 倍）是检测器颗粒。黄金制造方面的进步，包括共价金颗粒和纳米壳（nanoComposix，San Diego，CA），可以将分析灵敏度提高 5-10 倍。新颗粒，例如高度着色的纤维素纳米珠 NanoAct™（Asahi-Kasei Corp，日本），在多种检测中将灵敏度提高了 10 倍。使用荧光颗粒，特别是铕 (Eu) 螯合物掺杂的聚苯乙烯胶乳颗粒，可以进一步提高分析灵敏度。基于 Eu-latex 的 LFA 比基于胶体金的分析提高了 50-100 倍（内部数据；DCN Diagnostics，Carlsbad，CA）。

与 LFA 相比，用于传染病的核酸诊断分析需要昂贵的基础设施、复杂的设备和复杂的过程。由于其卓越的性能和准确性，它们通常是衡量 LFA 的黄金标准方法。

在诊断传染病应用中，核酸检测被广泛使用，但需要扩增步骤，包括 PCR 或等温扩增等方法。尽管核酸检测的性能普遍优越，但复杂的实验室环境、较长的周转时间和较高的实施成本是显着的缺点。

最近，分子诊断和侧向层析在POCT相交，横向流动被用作核酸检测的读出技术（例如，Mesa Biotech）。此外，随着基于 CRISPR 的诊断测试的出现，使用横向流动平台将这种高度敏感和特异性的诊断带到护理点 (POC) 是自然而然的下一步；几个地点正在进行这方面的工作。

应用和市场规模

总体而言，LFA市场按应用可分为兽医诊断、食品安全与环境检测、药物开发与质量控制检测、和占比最大的临床/POC检测。

推动临床/POC 检测市场增长的因素包括人口水平上升、慢性病流行、2020 年冠状病毒大流行的出现、降低医疗成本的压力越来越大，以及对以患者为中心的护理需求增加；由于这些因素，市场可能会超过先前的预测值。

预计 2021 年及以后的额外增长主要是由全球严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 大流行推动的，需要在美国和全球范围内大幅增加抗原 LFA 的数量，尤其是在中低端收入国家。

作为人类 LFA 市场的很大一部分，传染病侧向流动检测可以进一步区分为其他类别，例如

• 呼吸道感染（包括流感、SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒、Strep A）；
  
• 蚊媒疾病（包括疟疾、登革热、寨卡病毒）；
  
• 性传播疾病（衣原体、梅毒、淋病）；
  
• 结核;
  
• 血源性病原体（HIV、乙型肝炎、丙型肝炎）；
  
• 和其他传染病。
  

LFA 的传染病市场规模很复杂，因为各种因素推动了各个市场的年销售额和增长。例如，传染性呼吸道疾病的销售通常是季节性的，并且取决于严重程度以及在不同人群和地区之间的传播。

传染病 LFA 的性能也在推动市场发展，因为竞争性技术，尤其是分子诊断技术已经占据了很大的市场份额。临床和分析灵敏度通常更高，在分子检测中代表更好的价值，但 LFA 成本和检测时间仍然优越，从而支持 POC 和家庭检测的巨大市场，并扩展到中低端收入国家。

在 SARS-CoV-2 大流行之前对市场规模和增长的预测显示，到 2022 年，全球 LFA 市场将达到 82.4 亿美元，到 2025 年复合年增长率为 8% 和 96.5 亿美元。预计增长率最高的最大传染病市场将是热带传染病，疟疾和结核病 (TB)，以及艾滋病毒和流感。

新型冠状病毒病 (COVID) 大流行极大地影响了该市场的预期发展。
首先，对 SARS-CoV-2 抗原和血清学检测有很大需求。美国最大的 3 家快速检测生产商 Abbott、Quidel 和 Becton Dickinson (BD) 公布的公司财务业绩显示，从 2020 年第四季度到 2021 年第一季度末的总销售额超过 55 亿美元。

伴随销售而来的是基础设施的大量建设，这将推动其平台和产品菜单的未来增长。例如，BD 宣布它已在 2021 年第一季度末部署了超过 70,000 个 Veritor™ 阅读器平台。这种渗透到小型实验室、药房和最终家庭的水平将推动 LFA 市场的全新发展。

结合最近进入横向流动开发和制造的公司，例如 Luminostics Inc. (Milpitas, CA)、Celltrion USA Inc. (Jersey City, NJ)、Ellume Ltd. USA (Valencia, CA) 和 Salofa Oy (Salo,芬兰），所有这些都拥有 EUA 批准的抗原检测分析，通过 NIH RADx 等项目获得高水平的赠款资金，以及公众对自我测试和家庭测试的兴趣，横向流动市场有望在短期到中期显著增长。

SARS-CoV-2 大流行导致整个供应链的产能扩张，从原材料到试剂，再到制造能力，和成品。然而，它也对其他主要的全球卫生措施及其相关的诊断市场产生了不利影响。全球基金最近的一份报告描述了全球发展中经济体市场对艾滋病毒、疟疾和结核病检测的影响，该报告基于对 24 个非洲和 7 个亚洲国家的抽样调查。在 2020 年 4 月至 2020 年 9 月期间，艾滋病毒检测数量下降了 41%，结核病检测和筛查下降了 52%，疟疾检测和诊断下降了 56%。

CDC 报告的流感季节和检测市场在 2020 年受到严重干扰，目前尚不清楚人口行为变化将对未来的流感模式产生何种影响。预计 COVID 与其他呼吸道感染的鉴别诊断需求将出现强劲增长，因此包括流感 A/B、SARS-CoV-2 和其他呼吸道合胞病毒等联合检测可能会显示出持续的强劲增长。

简而言之，目前的几乎不可能准确预测未来几年 LFA 市场的规模。然而，一些广泛的结论是可能的：

• LFA 市场有望持续强劲增长；
  
• COVID 测试市场将随着时间的推移而减少，
  
• 但随着新变种和使用场景的出现以及家庭测试市场的成熟，它可能会在几年内保持最大的行业；
  
• 随着全球供应能力的增加和发展中经济体的需求随着时间的推移而恢复，传统应用中的非 COVID 测试市场将恢复；
  
• 公众对侧向流动技术的好处的新认识以及对其在监管和临床环境中的能力和好处的接受，将为其在非传统应用中的采用带来大量机会；
  

传染病侧向层析检测的发展和未来

本节介绍一些将影响 LFA 性能并影响 POC 设置中的快速诊断测试的相关技术。O'Farrell 对技术改进的不同方面进行了详细回顾，接下来将在这篇小型回顾中讨论当前最新的方法。

LFA 的每个关键组件都需要创新，以提高性能并允许它们在低资源端和发达国家环境中的高端应用中有效应用。在为任何应用开发 POC 诊断设备时必须解决的关键组件和技术是：识别和信号生成、读出和信号转导技术、样品收集和处理（例如浓缩和制备）以及设备设计。至关重要的是，随后将这些改进整合到精心控制的制造过程中，以生产高度敏感、可重现、定量的系统，如果需要，还可以生产多路复用系统。

最后，未来最关键的改进将是能够以高保真度客观地解释结果，并通过无处不在的数字手段从快速测试中收集和报告数据。

识别和信号生成：LFA 中的识别元件通常是抗体-抗原结合反应或抗原与替代识别分子（包括适体或亲和体）的结合。这些分子与抗原的结合常数是选择抗体时需要考虑的关键参数。抗体的亲和力常数通常比适体或亲和体强 10-100 倍。可以想象，可以开发出具有更高亲和力的转基因抗体，并进一步改善高灵敏度 LFA 的结合反应。此外，在 LFA 中加入高亲和力生物素-抗生物素蛋白反应通常可以提高检测性能。这种方法也可以应用于适体、亲和体或识别试剂，并且可以提高它们的性能。

读数和信号转导：视觉 POC 免疫测定最初被设计为在不使用阅读器的情况下由用户解释阳性/阴性的定性测试。大多数 LFA 仍然基于用户的主观解释，这是这些分析的主要限制。它将技术限制在定性应用；此外，解释和结果转录中的数据丢失和用户错误是主要挑战，尤其是在 POC 或家庭测试环境中。因此，开发具有集成阅读器系统的 LFA 通常是下一代检测所需的产品设计规范。这些阅读器系统必须能够以高保真度解释结果并将其传输给卫生当局。在选择阅读器系统和设计分析本身时，必须考虑各种技术、财务和监管因素。

标记粒子的选择是整个系统设计中的一项关键考虑因素，它会影响阅读器的选择和整体系统的性能。各种视觉粒子及其在 LFA 和基于荧光的分析中的性能，通常使用铕标记用于需要高分析灵敏度和量化的应用，正变得越来越常用。

LFA 的商业阅读器在当今市场上得到广泛使用，预计在未来几年内将变得更加普遍。根据应用环境和该应用的监管要求，使用多种类型的阅读器系统。

从广义上讲，它们可以分类为：
盒内或一次性阅读器，例如带有集成数字阅读器的 Clearblue 妊娠测试系统；为特定应用生产的面向消费者的定制低成本阅读器，例如 NIMA（加利福尼亚州旧金山）、Inne by Feral（德国柏林）；
完全验证和校准的台式临床阅读器，例如 Veritor (BD)、SOFIA (Quidel)；和手机摄像头加上应用程序。许多这些阅读器系统的背后是专门的 OEM 阅读器供应商，例如 Dialunox（德国斯托卡赫）、Planet Innovation（澳大利亚）、IUL SA（西班牙）、和 DCN Dx（加利福尼亚州卡尔斯巴德）以及应用程序供应商，例如 Abingdon Health（英国）和 Novarum/BBI（英国）。

手机和应用程序部分还得到定制软件供应商的支持，包括 Bond Digital Health (UK)，他们支持应用程序设计和后端数据管理组件。基于电话的应用程序被视为广泛采用 POC 快速测试的关键。

该应用程序可以实现多种功能，包括通过逐步说明提高用户性能，通过使用图像分析提高图像捕获和结果保真度，以及允许监管机构和卫生当局使用实时报告和数据库化结果。

样品采集。
样本收集对于 LFA 在任何环境中的性能都至关重要，尤其是在 POC 测试中。大流行说明了适当的样本收集对整体测试性能的重要性，尤其是在由最少或未经培训的 POC 用户使用时。

样本采集、处理和传送到 LFA 必须简单、稳健、故障安全，并且与设备完美集成，以减少用户错误和可变性。在无法集成的情况下，用户研究对于开发可在这些环境中使用的采样方法至关重要。

一个很好的例子是 CDC 鼻拭子收集指南，用于收集用于 POC 和家庭使用测试的 SARS-CoV-2 样本。研究表明，自行收集的样本在 COVID-19 测试中的表现与临床医生收集的样本一样好。口腔拭子是另一种可以与 POC 环境中的传染病 LFA 结合的样本类型。样品基质的变异性是测定变异性的一个重要因素，在使用口腔拭子样品时需要加以考虑。指尖血样是血清学检测的另一种理想样本类型。
设备设计

以用户为中心的快速诊断设备设计历来没有得到应有的重视。重点通常放在成本上，这意味着大多数人在想象横向流动测试时会想到便宜的白色塑料。然而，可用性是采用和正确执行分析的关键，并且是第一层设计问题。设计涵盖了用户体验的所有方面，将设备从包装中取出、获取正确的样品、将其交付给测试、运行设备以及解释和报告结果。

测试设备/卡盒的设计对于 LFA 性能至关重要，并且要求卡盒针对实际测试条和应用进行定制设计。在大多数高保真应用中，采用公开市场上现成的卡盒并不是一个可行的选择。设计定制的侧向流动试剂盒可以带来重要的性能优势，包括生产具有低可变性的检测、允许定量、将检测和试剂盒与读取器系统集成的能力、控制样品对测试条的吸附以及优化流动。

通过适当的卡式盒设计控制样品流动是 LFA 的一个关键特征，确保均匀流动、干燥试剂的溶解、颗粒结合物的流动以及最终转移到硝酸纤维素膜上。材料重叠上精心设计的压力点是确保均匀流过测试条的关键特征。需要额外考虑盒式封闭，因为如果施加过大的压力，关键的条带组件将被压碎和损坏。读取窗口的形状/角度对于读取器中使用的卡盒至关重要，以避免在照亮测试时产生阴影。
传染病 LFA 的未来方向

很难预测传染病横向流动市场在未来 5-10 年内将如何演变，因为许多因素都在迅速变化。谁能想到在 2021-22 年全球范围内将需要数以百万计的用于检测冠状病毒的快速抗原侧向流动检测来进行 POC 和家庭检测？除了检测新出现的传染病病原体的意外需求外，临床/POC 市场正在发生重大变化，包括产品的分销、购买和支付方式，这些检测的监管方式以及新市场如何例如 LMIC 需要大量此类测试。

在技术方面，分析开发人员的重点可能会停留在测试条的实施和持续改进上，以实现更好的灵敏度、重现性和量化。多路复用用于panel测试，例如呼吸panel、性传播疾病panel等，扩展测试菜单也将成为许多人关注的焦点。

对家庭测试和消费者诊断的需求将继续扩展设备设计，以包括对最少或未经培训的用户而言直观的集成功能。

POC 分子诊断测试代表了体外诊断市场的一个重要新兴部分，包括基于 CRISPR 的检测。随着分子诊断分析技术的发展，公司已经开发出全自动系统，并且越来越多的商用产品被归类为 CLIA 法规下的中等复杂性测试。这种分类使得测试可以从中心实验室转移到离患者更近的位置。

虽然实现中等复杂性分类是一个重要的里程碑，但最终目标是为 POC 设置开发和商业化测试，这些测试非常自动化且易于使用，以至于可以被授予 CLIA 豁免。

许多新兴的诊断公司都在追求这一目标。这些新兴测试通常使用扩增步骤（PCR 或其他扩增技术）作为样品，并结合 LFA 来检测扩增的核酸产物 (NALF)。

NALF 已成功用于越来越多的系统，开发和制造这些设备的方法相对简单。几个 NALF 系统/平台最近已经商业化，包括 AmpliVue（Quidel Corp.，San Diego，CA）、Amodia（Amodia Bioservice GmbH，Germany）、HybriDetect（Milenia Biotec，Germany）和 DCNovations NALF kit（DCN Diagnostics，Carlsbad，加利福尼亚州）。

基于这些系统的最新发展和成功，预计 NALF 将在未来几年通过将放大和横向流动步骤结合在单个设备中而成为重要工具。

世界卫生组织制定了 ASSURED 标准（价格实惠、敏感、具体、用户友好、快速且坚固、无需设备和可交付给最终用户）用于十多年前开发未来的诊断分析。横向流动平台仍然是满足这些标准的最佳可用试剂模式。

它展示了许多应用的灵活性，并满足接近更复杂技术系统水平的性能规范。横向流动本身并不是一种产品，而是每年驱动数十亿次测试的引擎，围绕这些测试的产品旨在满足任何市场空间。

尽管经过多年的努力和数十亿美元的支出，但仍然没有其他基础广泛的开放平台可以在灵活性和适用性、开发速度、成本、性能和供应链稳健性方面接近横向流动。




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