western blot 的原理是什么？

大v

western blot 的原理是什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/24589441

同花顺

刚好最近做完了实验，实验室要带师弟师妹做western blot实验了，western blot实验相关的经验总结写了几个晚上，这里一起分享给大家，刚入门的同学可以多看看~
WB，是Western blotting的缩写，即蛋白质印迹法，又称免疫印迹（immunoblotting）,也就通过电泳技术分离不同组分，再采用印迹技术将蛋白质转移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗体的特异性结合原理，用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法，这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等方面。


实验原理和用途

原理：通过电泳区分不同的蛋白组分，并转移至固相支持物，通过特异性抗体作为探针，对靶蛋白进行检测。

用途：定性检测，判断目标蛋白有无表达，目标蛋白分子量大小。常配合ELISA、FACS、IHC、IF等手段使用。

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一、Western Blot标准操作流程

样本制备→凝胶电泳→蛋白转膜→封闭→抗体孵育→检测显影




1、样本制备

1）实验前需要清楚的重要信息

• 所用的细胞／组织中表达需要检测的靶标蛋白吗？
  
• 表达丰度如何？是否在WB的检测范围内？
  
• 靶蛋白的亚细胞定位是哪里（在核还是在膜或者其它位置）？靶蛋白分子量是多少（分子量决定了电泳胶浓度以及转膜大小）？
  
• 是否需要特殊刺激才会表达？（有些蛋白无刺激不表达）
  
• 是否在疾病组织或细胞中才会有表达？
  
• 是否有多种异构体？是否有多种翻译后修饰形式？（决定抗体的选择）
  

利用数据库查询重要信息：

Uniprot：http://biogps.org/#goto=welcome
解靶标蛋白基因信息、别称、功能、可变剪切、定位及可修饰类型等
Proteinatlas：https://www.proteinatlas.org/
通过IHC提供基因在正常组织和肿瘤组织中的表达变化和定位
BioGPS：http://biogps.org/#goto=welcome
不同样本中基因的mRNA表达水平和靶标蛋白的表达水平
PAXdb：http://pax-db.org/
不同物种组织和细胞中蛋白丰度
DepMap：https://depmap.org/portal/
肿瘤细胞mRNA表达量

或者也可以在参考文献中找到相关蛋白的信息。

2）样本制备流程

• ① 样本获得：组织或细胞取材
  
• ② 样品裂解：从组织或者细胞中释放获取蛋白
  
• ③ 蛋白定量：获悉蛋白浓度，为后续电泳步骤提供上样量依据
  
• ④ 蛋白变性：使蛋白变性形成线性结构，方便跑胶和抗体结合
  

处理细胞--抑制剂与激动剂
靶标蛋白可能需要进行刺激才会表达，这时候就需要找到合适的细胞处理条件。

参考文献
产品说明书
预实验

部分蛋白的处理方法，仅供参考


蛋白酶和磷酸酶抑制剂

内源性和外源性的蛋白酶会在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。
在细胞裂解的步骤加入蛋白酶抑制剂混合物可确保蛋白免于降解，磷酸酶抑制剂可以保持蛋白的磷酸化状态。

蛋白酶和磷酸酶的成分组成：


获得高质量的裂解物
根据情况，结合超声、匀浆等物理方法，配合去垢剂裂解。

超声去除裂解样品中DNA干扰，经过超声处理过的样本得到的结果更清晰。

尽量使用新鲜的样品，新鲜的样品制备提取物背景较低。

细胞组分分离
细胞组分分离（cell fractionation ）是指把细胞的各种细胞器或不同组成成分分离的过程，方便快速的分离细胞组份用于下游分析。

产品推荐：Cell Fractionation Kit  #9038

试剂盒组成


细胞组份分离纯度检测抗体套装，提供一站式解决亚组份分离鉴定方案：

产品推荐：Cell Fractionation Antibody Sampler Kit  #11843

不同的亚细胞定位上蛋白的表达不一样，因此在实验前就应该确定目标蛋白的亚细胞定位。


蛋白定量
凝胶电泳时，要求蛋白的上样量尽量一致，后续的结果才更加可信。
为了后续在WB曝光的时候作为内参保持一致的前提。
定量方法


目前主流的蛋白定量方法是BCA检测法，去垢剂兼容性更强。
蛋白浓度测定试剂推荐：

产品推荐：BCA Protein Assay Kit  #FMS-W-002
产品推荐：考马斯亮蓝（Bradford）法蛋白定量试剂盒 #FMS-W-001

蛋白变性
普通的SDS-PAGE上样缓冲液组分：SDS、还原剂、甘油、染料以及Tris-HCl（pH6.8）等。
其中最重要的是需要了解溴酚蓝的作用为示踪。


膜蛋白注意事项：
跨膜蛋白有二硫键形成和糖基化等翻译后修饰。请尝试如下条件：

在loading buffer 中加入还原剂，如beta 巯基乙醇，不要煮沸，使用低于70°C的温度，孵育30-60 min。

样品制备的建议



2、凝胶电泳

1）凝胶及电泳液准备
2）上样
3）电泳
主流凝胶：不连续凝胶-浓缩胶/分离胶


在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。



如何选择凝胶浓度
凝胶的分辨能力由凝胶的孔径决定，孔径由浓度共同决定。原则有2点：

高比例的凝胶具有较小的孔径，用于分离分子量较低的蛋白。
低比例的凝胶具有较大的孔径，用于分离分子量较大的蛋白。

如何选择凝胶类型？


制备凝胶
pH值正确，妥当的保存，APS需新鲜，现配现用。


保持所有装置清洁。


分离胶勿倒过满，给浓缩胶留一定的距离。


凝胶需缓慢凝固，胶太硬电泳时易烧。


上样
将样本加入到样本孔中




蛋白marker
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准（蛋白预染Marker）。

产品推荐：彩虹预染marker  (5-245 kDa)  #FMS-WB003

电泳
蛋白质现在带有负电荷，在电流作用下由负极向正极移动。

产品推荐：Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X)  #FMS-WB032

电泳仪
电泳仪优势：2膜/4膜、兼容性高、性价比高、配件适配性高。




3、转膜

1）转膜
2）效率验证
膜的选择




转膜的方法
湿转；半干转；干转





转印仪器


转膜效率验证
带负电荷的丽春红染料能够与膜上带正电的氨基酸发生可逆结合，以判断转膜效率。

CST相关产品推荐：Ponceau S Staining Solution  #59803

转膜中的要点与建议


4、封闭

转膜完成后要用高蛋白的封闭剂对膜进行封闭，目的是防止抗体和膜发生非特异性结合。

化学发光法：含5% 脱脂奶粉的TBST
荧光法：含5% 脱脂奶粉的TBS

条件：室温封闭1小时
福麦斯相关产品推荐：

脱脂奶粉 #FMS-WB020；
BSA  #FMS-WB021；
Animal-Free Blocking Solution (5X)  #15019

5、抗体孵育/检测

1）抗体稀释
2）一抗孵育
3）洗涤
4）二抗孵育
5）洗涤
6）检测
稀释缓冲液--依赖于特定的抗体
含5%BSA或5%脱脂奶粉的TBST缓冲液。
说明书确认抗体的最佳稀释液。
孵育--过夜孵育会改善抗体结合
建议一抗4度孵育过夜。


内参蛋白选择原则





http://www.ptgcn.com/media/qwyjpvc3/experimental-technical-manual-v5.pdf

内参蛋白选择指南
注意：没有一种内参蛋白，适用于所有样本的Western Blot，要根据自己的样本选择合适的内参。


洗涤
洗涤缓冲液

建议使用TBST进行抗体稀释和洗涤。洗涤三次，每次5-10分钟。
对于图中所有抗体，TBST比PBST可以产生更强的信号。

二抗孵育
较强的封闭剂稀释二抗可降低背景，建议用含5%脱脂奶粉的TBST稀释二抗。
如下图，用5%脱脂奶粉的TBST稀释二抗比BSA背景更低。


IP后蛋白进行WB实验，可使用构象特异或链型特异二抗，以避免IgG重链或轻链的干扰：

产品推荐：Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb  #3677；
产品推荐：Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb  #3678；
产品推荐：Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)  #5127

检测--ECL发光
化学发光法--市场占用率最广泛的高灵敏度检测方法。
ECL发光液：指一种具有较高的化学发光强度的试剂。
一般使用的发光液A和B，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，A液和B液反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。


WB加速神器--SNAP i.d. 2.0
使用WB加速神器SNAP i.d. 2.0，30分钟可完成实验。





Snap i.d. 原理


Snap i.d. 与传统方法的实验结果对比


二、Western Blotting检测的操作方法和注意事项













三、Western Blotting 实验问题及解决方案

正常条带示例


问题1：有污渍或斑点，整体背景普遍偏高


问题2：出现白色条带


问题3：出现非特异性条带


问题4：信号弱或无信号
Western BLoT Immuno Booster（制品code T7111A）可有效改善结果。
Western BLoT Rapid Detect v2.0（制品code T7122A） 可有效改善结果。


问题5：膜上部分无信号


问题6：条带扩散


四、Western Blot中结果条带的各种稀奇古怪结果图解析

1. 啥也没有

原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。
解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。
经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。

2. 高背景

原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够
解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。
经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。

3. 非特异性条带

原因：一抗非特异性与蛋白结合
解决办法：更换一抗
经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

4. 条带中出现边缘规则的白圈

原因：电转中膜和胶之间存在气泡。
解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡
经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。

5. 条带中间出现白色（反白）

原因：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了
解决办法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。
经验：如果你足够迅速，可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。

6. 出现黑点和黑斑

原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合
解决办法：封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗
经验：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。

7. 条带拖尾

原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长
解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。
经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5min*5次，不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。

8. 出现重影

原因：荧光强度比较高，在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离
解决办法：X光片放上去之后，就不要动了，即使放歪了也没关系。
经验：有的时候出现重新刚好在上下位置，并且重影会相对弱一些，不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。

9. 出现非均一性背景

原因：膜可能曾经干过
解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干
经验：在封闭的时候，洗一抗，洗二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。注意与高背景区别。

10. 某个条带变形

原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒
解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。

11. 条带呈哑铃状

原因：配置胶有问题
解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用
经验：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，不知道大家有没有出现如下的配胶情况，下图中示意拔完梳子之后的结果，如果你拔完梳子之后出现图中下面部分的样子，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。

12. 最边缘条带弯曲

原因：电泳电流不均一
解决办法：换用新的电泳槽； 不使用两边的两孔
经验：一般我们使用的是10孔的的胶，如果你上样刚好10个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。

13. 其他问题
（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。
（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。

14. 电泳过程中出现现象及问题
（1）整个条带呈 “ ︶ ” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。
（2）整个条带呈“ ︵ ”： 凝胶左右两头没有凝固好
（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。
（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒
（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。
（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。

有时间再把一些经验分享给大家，今天就先到这里~
点个赞同，祝你实验顺风顺水~






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队长是我

不像组织切片HE染色, 免疫组化和免疫荧光那样可重复(见本人另一文章 石蜡切片和冰冻切片之高质量HE染色、免疫组化、免疫荧光染色)，Western blot常常被我们叫做"玄学"，因为这门技术让人琢磨不透，很难做到结果可重复，明明上了相同体积的同个样品，可常常出现复孔的条带趋势不一致。然而，经过我硕士期间反复用心琢磨，目前我有九成的把握做到了WB结果可重复，今天在此向各位同行分享一下我的经验，希望能帮到正在经历WB折磨的你，也欢迎"WB大神"的批评指正。



笔者在丁香园的个人主页

我们知道WB实验步骤繁琐，一次实验历时也不短，从提取蛋白到显影结束可能要花三天，我们就讲一下这里面的一些关键环节，若想探讨更多细节，欢迎在讨论区留言交流，我尽量及时回复。如果需要加急答疑，可以私聊我微信（ _17665739136, 有下划线），可语音或者腾讯会议讨论。主要讨论四部分内容，分别是实验步骤及其关键细节，制胶注意事项，WB常见问题分析和条带的ImageJ 统计分析教程。
1、 实验步骤
1.1 蛋白提取、定量及变性
1.1.1蛋白提取和定量
首先需要强调的是，蛋白提取是影响WB结果最重要的环节。该过程最重要的是防止降解和保证较高的蛋白浓度。防止降解主要有两点，一是裂解前注意保持样品处于低温环境中，二是裂解时加入足够的蛋白酶抑制剂。我们习惯先用冰冷的PBS做心脏的体循环灌注（步骤见另一组织切片经验帖），然后冰上取脑，分离各脑区（嗅球，皮层，海马，中脑，小脑，延髓，丘脑，纹状体）后置于1.5EP管中，用液氮速冻后转移至-80度冰箱长期保存。接着是保证蛋白浓度，即要加入适量的裂解液，太少会使蛋白提取不充分，太多则蛋白浓度太低，一般经验是这样的，细胞样品例如一个六孔板的细胞加60微升的裂解液，动物组织的话每毫克组织加10微升裂解液。研磨完后最好再冰上超声（超声破碎仪）进一步处理，超声探头至少置于液面0.5厘米一下，以防止产生气泡，使用30%的输出功率，超声5秒，停5秒，连续6个循环。注意事项是，用1.5mL EP管装蛋白液，至少200微升总体积，最多1000微升，太少容易产气泡，太多会溢出，工作时保证超声探头保持在液面以下4mm甚至更下（防止产气泡）。超声对提取膜蛋白和核蛋白尤其有效，其实对胞质蛋白也有好处。超声不仅可以破碎细胞和细胞器，而且能促进蛋白质和脂质、核酸分离开，得到的蛋白溶液更纯。如果没有超声破碎仪，可用1毫升注射器替代，冰上反复抽吸1分钟左右，注意不要产生过多气泡。
(需要灌注分脑区取材的视频可以通过微信获取，由于比较血腥，不宜直接放到文章里。)
蛋白充分裂解后12000 g 4℃离心15min，提取上清，注意勿吸取到沉淀。BCA定量，按照试剂盒说明书操作，注意要做复孔，最好三个复孔，至少两个。加完样后注意勿剧烈振板，以免不同孔之间的样品窜开。标准曲线的R值平方大于0.99方可使用。判断BCA测量是否准确的参考之一是同个样品的复孔之间的OD值相差非常小。加样前注意混匀，建议在振荡器旁边操作，每管样品一振荡完尽快加样。
1.1.2蛋白变性
加上样缓冲液后100摄氏度煮10分钟，蛋白上样缓冲液有两种还原剂（打开二硫键维持一级结构）可选，一种是beta巯基乙醇，气味很大，毒性较大，另一种是DTT（二硫苏糖醇），气味较小，毒性较小。两者的作用是一样的，但特点不一样，前者更容易与氧气反应，稳定性比后者差，如果在常温下暴露在空中，前者只能维持24小时的活性，后者却可以维持7天左右。所以该如何选择？如果是蛋白样品较少，跑几次就可以用完的样品，这时选择beta巯基乙醇。如果样品很多，计划跑上几十次的，优先选择DTT。不管用什么还原剂，都建议变性后分装-80度保存。
1.2 SDS-PAGE凝胶配制
1.2.1配胶前准备
首先强调一下，一块好的胶是跑好蛋白的前提，所以这个环节也不容忽视。玻璃板的选择，一种是1.0毫米厚度的，另一种是1.5毫米的，这个厚度选择也是有讲究的，如果上样体积小于10微升，优先选1.0毫米，否则选1.5毫米的。原因是什么？答案在转膜部分揭晓。还有分离胶的浓度也要选择适合的。然后玻璃板和梳子要洗干净，晾干。装板，注意厚板和薄板的底部要对齐，否则会漏胶。加制胶的各成分前，要观察液体是否有沉淀，有沉淀的尽量不要用。
1.2.2制胶
按配方说明依次加入分离胶的各组分，加完SDS后先简单手动摇匀几下，然后迅速加入过硫酸铵和TEMED, 摇匀，紧接着就灌胶，为缩短操作时间，可以直接倒或者用移液枪转移，推荐大容量的移液枪（比如国产大龙5毫升的，便宜又好用）。然后是压胶，我习惯用95%的酒精，我也用过纯水，感觉纯水压没那么好，由于水的密度较大，会把分界处的胶压得膨大。静置20-25分钟后（确保胶已经凝固，可以多预留一点胶在烧杯或离心管中用来指示胶是否已经凝固）把酒精倒干，用吸水纸吸出多余的酒精（注意纸尽量不要触及胶）。然后配压缩胶，同样的操作，关键是梳子要插得快，要小心防止梳子下产生气泡，然后静置30分钟，然后尽快浸泡于超纯水或者电泳液中，或者撒点纯水在玻璃板上用保鲜膜封包，然后4度保存（建议保存时间不要超过3天，时间长胶中的聚丙烯酰胺会部分水解，影响胶的终浓度）。如果是当天跑胶，我会等上层胶凝2个小时再用，但要注意防干燥缩水，加完上层胶30分钟后先浸泡于液体中。所以我一般提前一天制胶，第二天就用。
1.3 蛋白电泳
1.3.1上样前准备
把玻璃板和胶组装到电泳芯上，注意密闭性（否则漏液），如果内槽漏液就不是匀强电场了，最后条带可能就不是一条直线。然后内槽倒满电泳液，拔梳子，这一步要小心，梳子要两边一起缓缓往上拔出，然后观 察泳道内有无脱落的胶粒或者胶丝，有的话用1毫升注射器吸出。然后从冰箱取出蛋白样品，解冻。准备振荡器。
1.3.2 上样和电泳
注意，上样后蛋白会开始慢慢在胶中弥散，所以上样越快越好。我习惯先上蛋白Marker,再上蛋白样品，蛋白上样前确保样品完全解冻和充分振荡（推荐使用振荡器振荡），吸的时候没有拉丝即可，建议上样前五分钟把样品从冰上取出来，不然样品中SDS可能会结晶析出，从而影响电泳效果。上层胶80V 25-30分钟，下层胶120V 60-65分钟。以下是正常电泳示例：



溴酚蓝准备进入下层胶（marker 未分开，溴酚蓝已压窄）



溴酚蓝快跑至下层胶的一半了（marker 已分开，所有泳道的溴酚蓝几乎在同一水平线）

1.4 转膜
1.4.1转膜前准备
我会在电泳结束前60分钟准备，把转膜液配好置于4度冰箱预冷，然后裁膜，准备转膜装置，准备碎冰和冰砖。转膜前把膜置于甲醇溶液中活化1分钟，然后转移至转膜液中平衡3分钟后备用。
1.4.2 转膜
组装转膜三明治夹，这一步很关键，最重要的是胶和膜之间不能有气泡且膜与胶要保证贴合紧密（否则会翻车，详情见条带异常部分），可以加多点转膜液泡着。组装好后加满转膜液（快要溢出外槽），设置电源参数，我习惯用恒流转膜，200-280毫安，1-2.5小时，根据分子量定，如50KD的分子用60分钟就够了。如果一个电源带两个转膜大槽即四块胶，我就会用恒压70-110V。这个过程最重要的是做好降温。这里简单说一下蛋白分子量与玻璃板厚度，分离胶的浓度，转膜电源参数的选择问题。如果是能用1毫米的玻 璃板就不用1.5毫米的，因为转膜是在电场的作用下蛋白分子从胶上迁移到膜上，1毫米胶的蛋白迁移距离要比1.5毫米的短1/3。选择更薄的胶可以减少转膜时间，从而减少发热，以免胶变形，条带也会更好看。然后是分离胶的浓度，如果是150—200KD的分子选10% 以下的的分离胶，200—300KD的选8%的,300KD以上的选6%的，小于30KD的200mA 30分钟，30-100KD的按分子量的数值算，如70KD，250mA 70分钟；100-150KD的250mA 100分钟；150—300KD的分子转膜条件用280毫安(以上均是对于1.0mm的玻璃板来说的，1.5mm的要适当延长时间)，120分钟足矣，前提是胶的浓度相适应。
1.5 封闭孵一抗
1.5.1 封闭
转膜结束后，把膜先用TBST泡洗两遍再用5%脱脂奶粉（优先推荐）或者BSA室温封闭1-2小时。注意一定要让蛋白面充分接触封闭液。
1.5.2 孵一抗
脱脂奶粉封闭 的话，要用TBST泡洗三遍再转移至一抗溶液中，BSA封闭的可以直接转移至一抗中。如果膜的宽（膜是一个长方形，这里的宽与长相对应）不大于8毫米，我习惯置于15毫升离心管中孵育，两条膜"背对背"式放置于一个管子里（3毫升液体即可）。如果大于8毫米，就用普通的5格的一抗孵育盒（4毫升即可）。4度过夜，一般是12-18个小时，注意放置水平，最好用摇床。内参等蛋白丰度很高的如果孵久了可能出现条带连在一起的情况，这时可以缩短孵育时间或者降低一抗的浓度。另外推荐一个经济实惠的抗体保存方法：一抗工作液每次用完尽快保存于-20℃或-80℃，可大大增加一抗工作液的使用次数，只要溶液未出现明显沉淀或浑浊，就可以继续使用。一般情况下按照此方法保存，配置一次一抗工作液可以重复使用10次以上；如果条带出现信号明显减弱而一抗工作液未出现浑浊，可以适当补充一抗母液（补充原来的一半即可）。
1.6 孵二抗显影
1.6.1 孵二抗
室温一个小时足矣。这步要注意的是建议用3%BSA（推荐）或者脱脂奶粉稀释二抗，这样背景会干净许多。也要注意膜的蛋白面要充分接触二抗溶液，我一般一条膜一个槽地孵。同样，二抗工作液也推荐保存于-20℃或-80℃，至少可以重复使用3次，直至出现沉淀或浑浊。注意，若使用脱脂奶粉稀释二抗，一般只能只能使用一次，除非同一天使用，可用两次。
1.6.2显影
这一步有个细节可能有些同学没注意到，就是ECL发光液要与HRP反应一分钟后显影效果才会更好，还有要注意的是显影液要均匀覆盖，一般第二次显影（加新的显影液）比一次好看。
2. 制胶技巧
说到WB制胶，相信很多同志都有说不尽的"翻车"故事。俗话说的好，工欲善其事必先利其器，SDS PAGE凝胶就是我们做WB要利的器，因为高质量的胶是跑出漂亮条带的重要前提之一。
2.1 SDS PAGE 凝胶制备
2.1.1 玻璃板梳子的清洁
先用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮，然后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗即可，37度烘干或者吹风筒吹干，注意别用热风长时间近距离吹，厚玻璃板两侧的边条是用粘胶粘在一起的，高热会使粘胶融化，久而久之可能引起密闭性不良甚至边条脱落。
2.1.2 制胶试剂准备
超纯水，30%丙烯酰胺，pH8.8Tris-HCl，pH6.8Tris-HCl，10%SDS，10%过硫酸铵（APS），TEMED，还有95%酒精（压胶用）。注意试剂的有效期，是否澄清透明，若有沉淀或晶体析出，请更换。30%丙烯酰胺注意避光4度保存。pH8.8Tris-HCl和pH6.8Tris-HCl容易出现沉淀，另外注意这两个试剂有两个浓度的，分别是1.0M和1.5M，根据你的配方表来买。10%SDS低温（4度以下）时容易结晶析出。APS化学性质活泼，常温下暴露于空气下容易变质失效，一般建议配好后分装冻于-20度冰箱。TEMED气味恶臭，挥发性强，具有神经毒性，使用时屏住呼吸，在通风的环境下使用，注意密闭避光保存于4度。
2.1.3 制备分离胶
按照配方表依次加入相应体积的试剂（1.0mm玻璃板一块胶总体积5.0ml，1.5mm玻璃板一块胶总体积7.5ml足矣），加完SDS后加APS前可以先混匀，然后迅速加入APS和TEMED,马上混匀（手摇或者振荡器摇匀），灌胶，注意胶的高度，要留有足够的空间给压缩胶，一般压缩胶的深度要求是梳子下缘再往下1厘米左右。然后用95%酒精压胶，注意加酒精时要缓缓注入，并且要边加边移动枪嘴，以免酒精在同一位置冲出一个凹陷。室温静置25分钟
2.1.4 制备压缩胶及插梳子
先判断下层胶是否已经凝固，然后倒掉酒精，再用吸水纸吸干残余酒精，注意纸不能戳到胶面。然后按步骤3操作，混匀上层胶试剂后迅速灌胶，可以直接倒，但要注意别倒多了导致其他玻璃板不够，然后迅速插梳子，一次性操作，不可拔出再插。室温静置20分钟
2.1.5 凝胶的暂存
根据剩余在离心管中的上层胶是否已经凝固来判断玻璃板中的上层胶是否已经凝了。确认无误后小心取下玻璃板，用保鲜膜包裹，每块玻璃板分别包，然后浸泡于纯水中置于4度冰箱保存。一般不要放置不要超过一周。
2.2 常见翻车点及其对策
2.2.1 漏胶
90%以上都是由于玻璃板没对齐所致，技巧之一是:玻璃板一定要干燥，因为有水玻璃板会吸得很紧，不容易对齐。另外手法技巧是:一手食指指腹按压厚玻璃板一侧上缘，拇指指腹按压薄玻璃板同侧上缘，两指向下按压的同时另一手锁上同侧锁扣，同样的手法锁另一侧。另外漏胶的原因可能是玻璃板底部缺损，厚玻璃板边条密闭性不良，塑料夹子太松等。豪不夸张地说，本人自从发现这个技巧后再也没有遇到漏胶了，所以极力推荐给大家。
2.2.2 胶不凝
99%以上都是因为APS失效了，注意事项在第一部分的步骤2中详述过。其他原因也可能是TEMED失效或者胶没凝好就被晃动过了。
2.2.3 胶凝得不均匀
玻璃板没洗干净，表面有灰尘等杂质，试剂有沉淀，没混匀，加酒精冲得太快，酒精没干透等。
2.2.4 胶中有气泡
两种情况，一是下层胶有自底部向上出现的成串气泡，这是由于胶垫材质(类似海绵，胶垫在被挤压时气体冒进胶中)所致，改用实心的软胶垫或者加一层保鲜膜。另一种是梳子下缘有气泡，这是梳子插得不好，技巧是先插一侧，再插另一侧。



箭头所指为正在上升的一串气泡，原因是采用了含气的胶垫并用了1ml吸嘴加压玻璃板

2.2.5 上层胶边缘有缺损
这是由于该侧的厚玻璃板边条密闭性不良所致，原因在第一部分的步骤1提过，也有可能长期使用粘胶被腐蚀所致。
2.2.6 拔梳子后泳道有胶丝
这个问题曾经困扰本人几个月，后来看了不同公司的制胶配方表才发现问题根源。这是因为TEMED的量太多导致胶凝得太快，插梳子之前胶已经部分凝固。然后减少五分之一的TEMED即可解决这个问题，至今再没碰过类似情况了。
2.2.7 拔梳子后泳道歪了
梳子与玻璃板不匹配，不同公司生产的规格或多或少有差别，当梳子厚度比玻璃板内径稍大时，插或者拔都觉得很费劲，这时极易出现拔梳子泳道变歪，解决办法，在未灌胶前先试梳子是否匹配。
2.2.8 上层胶中电泳出现"漏样"
这个问题更是困扰过不少同行，包括本人。原因有两个，一是玻璃板与胶局部分离产生了缝隙，要注意取玻璃板（带有胶）时小心，不能有分离玻璃板与胶的动作；保存胶时注意不要将两块玻璃板直接接触，否则在取出来时由于两玻璃板之间充满液体，在大气压下吸得很紧，分开时容易将胶与玻璃板分离；拔梳子时也要小心，动作要轻；上样时也要注意，不能将枪头插得太深，以防将胶与玻璃板撑分离了。还有一个原因跟上样缓冲液可能有关，具体机制不清楚，经验之谈而已。
最后放一张图片大家看看，这是我认为的配的比较好的胶，梳子下无气泡，分界处呈现一条笔直的折光线，各处均质透明。



该玻璃外表面未擦拭干净，不过胶的质量还是很好的

3. WB常见问题分析
3.1 制胶问题
有人问，玻璃板洗干净纯水冲洗后还有水附着在表面，能不能直接配胶？我的回答:非常不推荐这种做法。原因有二，一是正文提到的，有液体两块玻璃板一靠近就吸附得很紧，不好对齐玻璃板而容易漏胶。二是，灌胶后残留的水会漂浮在下层胶表面，酒精压胶后，出现下层胶上缘会出现一种现象:上缘不是一条水平线，两端可能出现凹陷，甚至还能看到分界处凝得不均匀（折光性不一致）。所以总结一下，做实验不要总想着走捷径，该花功夫的地方还是不能偷懒。
3.2 电泳问题
部分同行可能还经常遇到"漏样"的情况，即上样后在压缩胶中电泳时出现个别泳道的溴酚蓝从底部渗漏到旁边开来，然后导致"漏样"的那个泳道的条带就会比预期的浅又窄（显影结果），影响非常大，一个泳道出问题整块膜可能都不能用了。这个问题也困扰了我了半年，查过很多资料。 最近我才找到了解决办法，特地跟大家分享一下。
漏样的直接原因是玻璃板与胶分离了，导致泳道里的样品可以直接渗漏到胶与玻璃板的缝隙中。主要原因在于操作手法，尽量避免使玻璃板与胶分离的动作，比如胶还没完全凝好前尽量别用力挤压玻璃板，收胶时轻拿轻放，组装玻璃板和胶到电泳芯上时不能太用力挤推玻璃板，拔梳子前先泡在电泳液（液体润滑作用）中再竖直向上拔，上样时枪头别太用力向下挤等。还有一种可能是玻璃板质量问题，有些玻璃板不平整，或者表面不亲水。最后可能就是胶的质量问题，比如压胶的酒精还没干就灌了上层胶（导致剩下层胶界面有缝隙），还可能是APS失效导致胶聚合不佳。
3.3 转膜问题
3.3.1 小分子（小于20KD）用0.22微米的PVDF膜转膜时间长会不会转透？
我相信这个问题困扰过很多同行，我也一样。我之前查过很多资料，也问问过很多经验丰富的前辈，他们大部分都认为不会转透，只有小部分人觉得会转透。我这几天就针对这个问题展开了实验，用两层膜覆盖于胶上，发现时间较短的时候第一层 膜（紧靠胶的）比第二层膜的条带浓集许多，Marker的颜色也是第一层比二层深色。如果转膜时间延长，结果就会反过来。所以，结论是，尽管用0.22微米的膜，转膜时间过长小分子真的会转透。最后我建议各位还是要注意选择适合的转膜时间，尽量短，如果必须要转稍微长点的时间（同一块胶有大分子要转的且裁胶不方便的），就放两层膜。
3.3.2 电泳完marker形状正常但转完膜marker出现涣散。
大家在做WB时或多或少地都会遇到转膜后膜上的marker出现涣散的情况，即marker形状不凝集，像笔墨在纸上晕开的感觉。这样的话，显影出来的条带也会不凝集，散开，信号低，背景不均匀且高。这个问题也曾困扰我一段时间，一开始一直怀疑是转膜降温不良所致，直到最近才找到真正的"元凶"——胶跟膜贴合不够紧密。有些三明治夹用久了会变形，一般是中部向外凸，遇到这种情况最好淘汰它。如果三明治夹未发生明显变形，极有可能是海绵用久了变得很瘪，这时最好的解决办法就是加多点滤纸或者加多一层海绵。自从我发现了原因之后再也没碰过转膜后marker不凝集的情况了，由此而产生的条带背景等问题也解决了。
3.4 显影后条带异常
3.4.1 背景不均匀（下图所示）


这是膜与胶贴合不紧所致，转完膜也能看到marker涣散。
改进办法：加多点滤纸或者加一层海绵。
3.4.2 “两端粗又深中间细又浅”（下图所示）。可能的4个原因：


3.4.2.1 转膜没做好散热，由于转膜槽中心部离外槽的冰块或者冰水混合物最远，故中心部散热最差，导致中心部蛋白转膜效率下降。
3.4.2.2 孵抗体时，有时膜呈拱形，中间向上凸时该部位的膜可能未充分浸泡于液体中，中间向下凸时该部位的膜可能直接贴壁，两种方向的结果是一致的，就是中间部的膜未能与液体充分接触。
3.4.2.3 活化前中间部膜被污染过，导致该部位的正电荷被中和了一部分。
3.4.2.4 我觉得这是最常见的一种原因：显影时，发光液覆盖不均匀，由于膜变形，在液体的表面张力和虹吸作用下，导致两端显影液分布与中间部不一致。针对第4个原因，我想到了一个解决办法。如下所示，滴加发光液后，再覆盖一张平整洁净的塑料膜（如密封袋），如此一来，显影液就基本均匀覆盖在整张膜上了，亲测有效，欢迎试用该方法。


       如果上述办法不起效，还可以尝试另一个办法：用新的显影液浸泡膜后，用吸水纸吸干表面游离的液体，再曝光，也常常能获得更好的条带。
3.4.3内参连城一条线


上图有两个问题，一是每个泳道连在了一起，为上样量过多所致。二是第二泳道该蛋白有明显的降解带。
有时我们为了跑一个表达量比较低的蛋白，会加很大的上样量，比如超过50微克总蛋白，这时我们目的蛋白可能跑出来了，但是令人头疼的问题也来了，内参连成一条线了。我最近摸索出可以解决该问题的办法，这里推荐给各位试试。就是缩短内参的一抗二抗孵育时间，比如一抗4度3-5小时，二抗常温30分钟，如果还不行就用抗体清除液洗脱三分钟后再封闭孵一抗二抗（洗脱后的一抗二抗时间就用常规的时间），这样基本能解决内参连在一起的问题，有需要的同行下次可以试试。
3.4.4 条带淬灭现象


为蛋白含量过高所致，可通过稀释显影液，缩短曝光时间，减少上样量，缩短抗体孵育时间等办法改善。
3.4.5 泳道背景高


常见原因是一抗特异性不好；蛋白提取不纯，含有较多的脂肪、核酸等；封闭不足等。
3.5 综合问题
3.5.1磷酸化小分子蛋白WB技巧
一个14KD的磷酸化蛋白我之前重复跑了接近50次，条带都不忍直视，要么只有背景，要么只有一条淡淡的几乎看不见的影，而且还要曝光300秒那种。然而今天用了自己辛辛苦苦配的5*loading buffer跑了一次，结果令我眼前一亮，当时我就忍不住惊叹了一声"哇塞，Well done！" 还有IL-1 beta,平时都是很浅很浅，今天也能有差强人意的条带了。
原因在于，我猜想是这样的，我们买的上样缓冲液都是已经加了还原剂的，这个物质化学性质活泼，容易被氧化，所以买的loading buffer不一定"新鲜"，可以肯定的是没有自己配的"新鲜"，因为我们配的都是用之前才加入还原剂的。那为什么用了"新鲜的"上样缓冲液就会跑得好？道理又是什么？我是这样认为的:还原剂的作用是打开二硫键，让蛋白质维持一级结构，这样跑胶的时候才能符合电泳的预期——蛋白质电泳迁移速率只与分子量有关，与空间结构无关。如果还原剂失效了，那么就会有部分蛋白保留一些二级结构，那就不是线性结构了，跑胶的时候这部分蛋白就会因为空间效应跑得慢，也因此可能没赶到预期的分子量位置上，所以目的条带位置上蛋白就比真实值少，条带就浅，甚至看不到。
3.5.2 条带信号太低甚至无信号（白膜）
最近看到很多同行在咨询条带出现信号太低甚至无条带、高背景、多黑点等问题。之前我也被这些问题困扰过很久，所以今天特地跟大家分享一下我在这方面的经验，希望能对大家有所帮助。其实这很可能是样品的问题，我们知道WB重中之重就是蛋白的提取，所以提取蛋白的时候一定要仔细，千万别在这个环节偷懒。下面我以提动物组织蛋白为例，讲一下我的经验。
第一，组织块称重时一定要快和做好冷冻，不要在称量过程让组织快完全解冻了，否则溶酶体酶会被大量释放，组织蛋白会被大量降解。第二，研磨时也要在尽量低温的环境中操作，我一般在冰上用手持式电动研磨仪研磨。第三，也是最重要的一点，研磨完后冰上超声，30%的功率，超声5秒，停5秒，连续6个循环。注意事项是，用1.5mL EP管装蛋白液，至少200微升总体积，最多1000微升，太少容易产气泡，太多会溢出，工作时保证超声探头保持在液面以下4mm甚至更下（防止产气泡）。超声对提取膜蛋白和核蛋白尤其有效，其实对胞质蛋白也有好处。超声的 作用是使蛋白质和脂质还有核酸分离开，使提出来的蛋白更纯，高背景往往是由于脂质和核酸与抗体的非特异结合导致。低信号和无条带可能是提取的目的蛋白结合了脂质和核酸，导致总分子量增大，不在预期的位置，所以在预期位置出现了低信号或者无条带。这个超声的好处我也经常跟我们实验室的其他同学推荐，得到一致的认可，现在我们实验室的同学们不管提组织蛋白还是细胞蛋白，胞膜蛋白，胞质蛋白还是核蛋白都采用了超声这个方法。

4. ImageJ 半定量分析条带
4.1 图片类型转换：打开图片，Image→Type→8-bit。



注意这里，如果本来是8bit就不用再改；如果是原来已经invert过了，后面步骤4.5就可以省略，勿重复invert。


4.2 降背景：Process→ Subtract Background，在弹出的对话框中，填上50，并勾选 Light background，点击OK。




4.3 设参数：Analyze →Set Measurements。在对话框中勾选Area、Mean gray value、Min& max gray value、Integrated density、Display label。  




4.4 设单位：Analyze →Set Scale。在对话框“Unit of length ”后面填上“pixels”（一般默认是inches），注意，其他的参数保持与下图一致。




4.5 黑白反转：Edit →Invert。  


4.6 选择测量区域：选择菜单栏下的不规则圆形工具或者矩形工具，将圆圈或者矩形工具手动调节圈住第一条带。


4.7 测量条带：点击菜单栏Analyze下拉出现的measurement，即可得出测量结果（IntDen所在列数值即为条带灰度值）。也可以点击快捷键（英文状态下的键盘M或者中文状态下Ctrl + M）
4.8 继续测量：重复步骤6和7，直至所有条带被测量完成。



注意，这时需要保持每个条带的选框大小一致（Area）。当鼠标显示为白色箭头时，长按鼠标左键移动选框，可保持选框大小不变。然后IntDen这列数据即为每个条带的平均灰度值。

4.9 导出结果：点击Results中的File按钮，点击Save As。导出结果为Excel格式。




您若觉得这个帖子有用，欢迎点赞、收藏和转发。有问题可以讨论区留言，急需答疑或者灌注取材的操作视频的可以加我微信私聊（ _17665739136,有下划线），可语音或者腾讯会议讨论，付费答疑，可通过图片，文字，语音电话讨论。先发图文描述清楚您的问题，然后语音电话讨论，每30分钟50元（语音通话时间）。
此外，笔者还有其他科研经验和知识文章分享，请需要的人点击以下链接自取：
1、Western blot实验技巧之蛋白样品制备、SDS-PAGE胶制备、跑电泳、转膜、孵育抗体、显影和ImageJ分析（来自一位可稳定重复WB结果的科研狗之四年经验总结）
2、“玄学”实验-Western blot的内参你选对了吗？
3、SDS-PAGE凝胶制备技巧，易翻车点及其解决方法汇总（五年经验结晶）
4、石蜡切片和冰冻切片之高质量HE染色、免疫组化、免疫荧光染色
5、冰切的免疫荧光到底需不需要进行抗原修复？
6、石蜡切片实验中的毒物（苯和二甲苯）与白血病的关系——发病机制
7、一文讲清免疫组化结果到底该选择阳性面积占比，平均光密度值，累积光密度值还是其他分析方法——ImageJ
8、Image J 统计免疫组化片子阳性信号的平均光密度值教程
9、组化片子如何利用Image J 进行阳性信号面积占比统计分析
10、期刊实时影响因子计算（保姆级教程）
11、使用Chat GPT润色英文论文是否会泄露文本，是否符合科研规范，是否增加查重率

感恩由您

Western blot，中文为蛋白质免疫印迹试验，简单来说是抗原抗体特异性结合。
电泳分离后的蛋白转移到固相载体PVDF膜上，以共价键的形式吸附蛋白质，并作为抗原结合特异性抗体。二抗作为显色标记，经过底物显色反应组织和细胞中蛋白的表达情况。



蛋白提取

1. 组织蛋白提取
相对于细胞而言，组织蛋白的提取对技术和外界环境要求会更高一些。因为我们养的细胞很多是根据具体实验选择的特定细胞，而组织大多是为了丰富体内实验的各种蛋白的混合体，目的蛋白的含量并不一定充分，而且其中还包含着丰富的蛋白酶、血液或者脂肪等干扰因素。
所以个人认为，提取组织蛋白一定要做预实验，这是很有必要的。可以摸清楚每次应该取多少重量的组织，什么样的离心条件可以去除血液和脂肪的干扰。比如像心脏、脾这类血液较多的组织，剪成米粒大小的小块儿后，加入适量PBS(PBS:PMSF=100:1，PMSF为苯甲基磺酰氟，蛋白酶抑制剂，30min内会降解一半，因此每次提取蛋白要加新鲜的PMSF)，7500g离心力，离心5分钟，去上清。如果感觉血液还是很多，可以重复上述步骤数次。
蛋白提取的全程要在低温环境下进行，以防止蛋白降解。30mg的组织对应500ul的RIPA裂解液（RIPA全称为Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA:PMSF=100:1），置于冰上，使用研磨棒或电动组织研磨器充分研磨30分钟，再置于冰上静止30分钟。
在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。

2.细胞蛋白提取
细胞蛋白的提取相对来说耗时会少很多，只是在贴壁细胞和悬浮细胞的处理方式上略有不同。
对于贴壁细胞而言，去除培养基后，用无菌预冷的PBS清洗3次，每次3分钟。对于像6cm的培养皿，我习惯每次加100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），转动培养皿，让裂解液接触到整个皿面。之后用细胞刮刀将皿里的细胞刮刀一侧，冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。
对于悬浮细胞而言，吸出培养皿中的培养基，按照传代时离心力大小和时间进行离心。离心结束后，小心的倒掉上清，加入100ul的RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1），冰上静置15分钟后，在12000rpm转速下，4度离心15分钟，取上清，测蛋白浓度。

3.测定蛋白浓度
蛋白浓度的测定一般选用BCA工作液（bicinchoninic acid），BCA工作液作为一种稳定的水溶性复合物，可以与二价铜离子结合，产生紫色复合物。562nm波长条件下测定吸光度，制作标准曲线，吸光度与蛋白浓度成正比。

4.蛋白变性
根据蛋白的体积，计算加入多少体积的1*loading buffer，煮沸5分钟即可。Loading buffer中主要含有溴酚蓝、二甲苯氰和甘油。前两者起到指示作用，甘油起到沉降蛋白的作用，以防加样时蛋白飘出。
电泳

1.制胶
根据目的蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶，8%、12%和15%三种浓度的分离胶就完全可以搞定日常蛋白的测定。一般测定100kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶；测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶，中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。
有的时候蛋白跑不出来，其实未必是分离胶浓度选的不好，也有可能是marker的问题。marker起到的是蛋白分子量指示剂作用，但是要根据蛋白分子量选择合适的marker。一般的marker分子量范围在10-130kDa之间，都可以满足正常蛋白的需要。
但有些分子量范围较广的marker，比如说6-250kDa，虽然说它范围很广，可中间的蛋白分子量并没有区分的很细，只适用于大分子或小分子蛋白，而对于30-70 kDa的蛋白并不是很适用。




2. 电泳条件
个人使用的条件一直是80V，300mA跑浓缩胶，120V，300mA跑分离胶，恒压电泳。当然了，这个电泳条件不是固定的，也有人选择恒流跑电泳。个人认为恒流和恒压对电泳的效果影响没有什么区别。因为配胶的成分中SDS起到的作用是破坏蛋白质分子和其它物质分子之间的非共价键。
解聚后的蛋白质分子与SDS形成的复合物带有负电荷，远远超过蛋白质本身的电荷量，所以就不存在不同蛋白质分子之间的电荷量不同造成的影响了，恒压或恒流都只是起到推动作用。
至于浓缩胶和分离胶的条件不同，我想这一点大家应该都很清楚了。浓缩胶中的孔隙较大，起到的作用是为了让蛋白质混合物在进入分离胶之前都到达同一起跑线，以便在分离胶中更好的分开，因此一定要充分跑完浓缩胶之后再调电压。
转膜

转膜分为湿转和干转。湿转就是把三明治结构放在转膜液中进行；干转，其实应该是半干转，虽然不放在转膜液中进行，但是滤纸也要事先泡过转膜液。有人说，湿转主要用大分子蛋白质转膜，半干转主要用于小分子蛋白质转膜，但是个人认为湿转就完全可以搞定大小所有分子量的蛋白，而且从转膜稳定率来说要好于半干转。
所以个人习惯于用湿转。一般情况下的转膜条件是220V，300mA，转膜时间是1小时20分钟。对于10-180kDa分子量的蛋白，这个条件是完全可以的。虽然网上有很多人说小分子量的蛋白需要缩短转膜时间，或者改变电压电流，但是本人试过用这个条件转8kDa的蛋白质，一样没有问题。相反的，我缩短了转膜时间，或者改成了100V，300mA的转膜条件，转膜的效果反而不好。
所以个人认为，转膜效果的好坏除了要考虑机器本身设定的条件外，还需要考虑一下其他因素。有很多新手用完转膜液忘记放回4度冰箱，时间久了，转膜液的离子成分就会发生改变，影响转膜效果；或者是滤纸使用太久了，也会影响转膜效果；又或者是要研究的蛋白自身性质决定的。Western blot并不适用于所有的蛋白，对于检测一些分泌型的蛋白，ELISA会更适合，所以也并不是说蛋白实验一定要用Western blot。
发光

选用ECL发光液发光。ECL发光液分为A液和B液，按照1:1的条件混合配制。洗膜结束后，倒出多余的TBST，但是也要在洗膜的塑料盘中留有一些，防止PVDF膜干掉。基本上1ml的工作液可以覆盖10cm3，发光的效果与发光液的新鲜程度有关，所以要现用现配。
ECL的发光原理是：发光剂中的鲁米诺被过氧化氢和HRP氧化，产生荧光，整个发光过程被增强剂增强了发光效果，可以将灵敏度提高到1000-100000倍，但是也会遇到猝灭的情况，除了成像机器老化的原因外，也与发光液的新鲜程度和一抗二抗的浓度有关。
质量好的发光液配合着合适的一抗二抗浓度，才能快速完美的发光。小于1分钟的发光时间固然是我们所向往的，但是碰上信号低的蛋白，我们也要想尽办法让它们显示出结果。对于信号弱的蛋白条带，我们可以手动调整发光时间少一些，比如说10sec，快速曝光比延长曝光时间的显影效果更好。
用各种软件处理分析蛋白条带

1.Photoshop CS6

PS软件在后期投稿整理图片方面会有很大作用，这里我想说的是利用PS改变条带的对比度，减少后续利用Image j对蛋白灰度值进行测定时的干扰。
正常机器发光之后的图片，背景都会泛蓝，我们可以选择PS软件中，图像-调整-去色，把条带背景统一调成灰色后再测灰度值。

2.ImageJ
利用Image j测量蛋白灰度值的方法，我想大家都很熟悉了，我就不详细的列出每一步了。
这里想提到一点，BCA测出的蛋白浓度有时会存在一定的误差。我们在测蛋白标准曲线时，得出的R值肯定是9越多越准确，但是实验过程中，我们往往只有一或两个9，导致内参发出来的效果也是各组略有差异。为了追求完美，我们可以通过内参的灰度值进行作比，以一个组的蛋白浓度为定量，适当调整其他各组上样量即可。
<hr/>知乎专属福利；助大家一臂之力、我为大家准备了一份基础实验protocol,细胞侵袭、细胞凋亡、细胞黏着、细胞周期等，不仅有细胞培养相关实验，还有包括不同研究水平实验技术Protocol，不同实验方法全流程，WB实验流程、注意事项、数据处理及写作、IHC实验流程、操作技巧、注意事项、图像分析等相关实验的详细步骤，全都是经过前辈们无数次验证过的，希望对大家的实验有帮助。
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同花顺

就Western来讲，我们要了解他首先是其定义，westernblot原理，western blot步骤，常见问题。
1.western blot
即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2.原理
简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。具体可看
westernblot原理3.步骤
（一） 蛋白样品制备
培养的细胞（定性）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。
3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
7.待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4.12000g离心，4℃，2min。
5.取少量上清进行定量。
6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
（二）SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板
（2） 灌胶与上样  
（3） 电泳   
（三） 转膜  
（四） 免疫反应   
（五） 化学发光，显影，定影   
（六） 凝胶图象分析  将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
具体可看
western blot步骤4.常见问题
1.        Western blot结果中的背景为什么较高?
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2.        Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议
目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
一抗不纯——纯化抗体
一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3.        Western blot结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议
检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
4.        其它现象：
膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。
具体可看
western常见问题解析

长长的路

刚好最近在做这个。。。正在摸索合适的抗体浓度
就是一种蛋白质的电泳分离，跑胶现在常见的是SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
1、利用带大量负电荷的SDS与蛋白结合，形成SDS-蛋白质复合物，从而可以忽略不同蛋白所带电荷对于蛋白在电场中移动速度的影响，使其移动速度只与分子量相关
2、利用聚丙烯酰胺凝胶内部大小不一的孔径，使得小分子快速通过，大分子受小孔径阻挡跑的慢，从而形成跟分子量有关的梯度条带
3、利用溴酚蓝这种有色小分子指示剂与样本混合，从而使不可见的蛋白电泳过程可监控，即：当跑在前沿位置的溴酚蓝到达凝胶底部时，即可停止电泳
4、利用可见，并已知各条带所对应蛋白分子质量的Marker蛋白作为标尺，相同分子质量蛋白会在凝胶中跑在相同水平，可以帮助你定位目标蛋白的大概位置
转膜现在常用的是电泳印迹法，这个没什么特别的
1、有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”，使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上
2、转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测
封闭：顾名思义，一般用小牛血清或者脱脂奶粉配的溶液，封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，使得最后显影背景干净
附抗体
1、一抗与目标蛋白结合特异性强，二抗与一抗结合特异性稍弱，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物
2、带有标记的二抗，即：酶连抗体，使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐转化为蓝色的产物。我们用辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，往膜上滴加发光液后，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。
3、照片中条带的灰度值不同代表蛋白量不同