我们常说核酸提取后要看纯度，有没有蛋白，苯酚，胍，糖等污染，请问这些杂质对下游实验有怎样的影响呢。？

虎威将军

生物实验
原文地址：https://www.zhihu.com/question/58736018

检验医师

核酸的纯度和浓度是评估核酸质量的重要指标，在分子生物学实验中具有关键意义。
一、核酸纯度

• 评估指标
  

• A260/A280 比值：这是最常用的评估核酸纯度的指标。纯的 DNA 样品该比值在 1.8 左右，纯的 RNA 样品该比值在 2.0 左右。如果比值偏低，可能表示存在蛋白质污染；如果比值偏高，可能有 RNA 降解或存在苯酚等残留。
  
• A260/A230 比值：该比值用于评估核酸样品中是否存在盐类、多糖、酚类等污染物。纯的核酸样品该比值一般应大于 2.0。比值偏低可能意味着存在上述污染物。
  

<li data-pid="v3Hq0UuB">影响纯度的因素

• 提取方法：不同的核酸提取方法可能会导致不同程度的污染。例如，使用酚 / 氯仿抽提法时，如果操作不当，可能会残留苯酚，影响核酸纯度。而一些商业化的核酸提取试剂盒通常经过优化，能提供较高纯度的核酸。
  
• 样品来源：不同来源的样品中可能含有不同的污染物。例如，组织样品中可能含有较多的蛋白质和多糖，而血液样品中可能含有较多的盐类和血红蛋白等。
  
• 储存条件：核酸的储存条件也会影响其纯度。如果核酸在不合适的条件下储存，如温度过高、湿度较大等，可能会导致核酸降解或污染。
  

二、核酸浓度

• 测量方法
  

• 紫外分光光度法：利用核酸在 260nm 处有特定的吸收峰来测量核酸浓度。该方法简单快速，但容易受到蛋白质、盐类等污染物的影响。
  
• 荧光染料法：使用荧光染料与核酸结合，通过检测荧光强度来确定核酸浓度。该方法灵敏度高，且不受蛋白质等污染物的影响，但需要专门的仪器和试剂。
  
• 琼脂糖凝胶电泳法：通过比较样品与已知浓度的核酸标准品在凝胶中的条带亮度来估算核酸浓度。该方法相对较为粗糙，但可以同时检测核酸的纯度和完整性。
  

<li data-pid="nQdLDgHP">浓度对实验的影响

• 核酸浓度过低：在进行分子生物学实验时，如 PCR、测序等，如果核酸浓度过低，可能会导致实验失败或结果不准确。例如，在 PCR 实验中，过低的模板浓度可能会导致扩增效率降低，甚至无法检测到目标产物。
  
• 核酸浓度过高：过高的核酸浓度也可能会对实验产生不利影响。例如，在 PCR 实验中，过高的模板浓度可能会引起非特异性扩增，导致结果出现假阳性。此外，过高的核酸浓度还可能会增加实验成本和工作量。
  

在进行分子生物学实验时，需要确保核酸的纯度和浓度符合实验要求。可以通过选择合适的提取方法、优化实验条件、使用高质量的试剂等措施来提高核酸的纯度和浓度。同时，在实验过程中，应定期检测核酸的纯度和浓度，以确保实验结果的准确性和可靠性。

大力水手

在回答蛋白，苯酚，胍，糖等污染对下游的影响之前，我们需要先知道这些污染物对纯度的影响，或者说怎样通过看纯度来看出来可能存在这些污染，以及这些污染是在哪一个步骤发生的，这样在下一次的核酸提取过程中才能避免这些污染。首先我们要先知道纯核酸“pure DNA&RNA”指的是什么？
大家应该都知道通过A260/A280与A260/A230的比值来看核酸的纯度，那这个范围标准到底是多少？Thermo和NEB给了两个标准，但是差距并不大，来看一下：

A260/A280	pure DNA	pure RNA
Thermo	1.8-2.0	2.0-2.2
NEB	1.85-1.88	~ 2.1

A260/A230	pure DNA	pure RNA
Thermo	1.8-2.2	1.8-2.2
NEB	2.3-2.4	2.1-2.3

那么通常来说，A260/A280与A260/A230的比值偏离上述值，我们就认为“不纯”，但是实际上，这两个比值的准确度是建立在核酸浓度和PH值在标准范围之内的，要不然仅看比值也并不能就说这个提取的核酸到底纯不纯，浓度和PH的影响可以看这篇
超详细Nanodrop结果判读！（上）<hr/>好了，假设现在我们知道A260/A280与A260/A230的比值偏离了标准值，可能存在污染了，那么究竟应该怎样判断是什么污染？是在哪个过程产生的污染？以及可能对下游实验有什么影响，我们一个一个污染物来看一下：

• 蛋白质
  

蛋白污染可以算是在核酸提取过程中最常见的一种污染，在酚氯仿抽提时，蛋白存在于上层的水相和下层的有机相中间，在吸取上清时很容易将蛋白一同吸出，造成核酸中的蛋白污染，在后续的逆转录或者qPCR反应过程中，蛋白残留会抑制或干扰酶的功能。
为了研究蛋白污染对DNA浓度与A260/A280比值的影响，Sean Loughrey 与Brian Matlock将DNA与蛋白质以不同比例混合[1]，对Nanodrop One数据结果进行分析，如下表所示。


总结一下
不同程度的蛋白污染，都会导致核酸浓度偏高，且蛋白比例越高，核酸的测量值（Original DNA）与真实值（Corrected DNA）之间的偏差越大。
蛋白污染会同时降低A260/A280与A260/A230比值，但是只有足够高比例的蛋白含量才能够引起比值的显著变化，并且A260/A230比值要比A260/A280比值变化更明显。如下图所示，当蛋白比例＞~75%时，A260/A280比值数据才低于最低可信值（1.65），而A260/A230在蛋白比例＞~40%时，比值就出现了明显的降低。这里需要注意的是，当蛋白比例＜25%时，A260/A280与A260/A230的比值均在可信区间范围内，所以下次实验的时候需要注意，当你发现A260/A280比值过低可能有蛋白污染时，蛋白的含量实际上已经很多了。


2. 胍盐
盐酸胍（GuHCl）与硫氰酸胍（GTC）都具有使蛋白质变性的作用，在核酸提取过程中能够快速破坏细胞膜，使得蛋白质变性沉淀[2]。GuHCl与GTC吸收波长在220-240 nm之间，胍盐残留会降低A260/A230的比值，如下图所示，红色：pure DNA；蓝色：污染物；紫色：两者混合[3]。虽然胍盐的残留会降低比值，但是实际上对下游实验的影响可忽略[3]。


3.苯酚/Trizol
在抽提细胞DNA时，苯酚可以使蛋白质变性，同时抑制DNase的降解作用。在抽提细胞RNA时，Trizol可以迅速裂解细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。苯酚与Trizol的吸收波长相似，最高吸收峰在~270 nm，但是Trizol在~230 nm处也存在吸收峰。如下图所示，苯酚残留降低两个比值的幅度并不明显，但是Trizol残留则会明显降低A260/A230的比值。


4. 多糖
多糖也就是我们常说的碳水化合物，这里需要注意的是，多糖残留一般都是由于样本组分中本身就含有碳水化合物（比如说植物），或者是胶回收样本，在溶胶过程中出现的胶残留。前者的话就增加样本预处理过程，后者可以延长溶胶时间，等胶全部溶解之后再进行纯化回收。
<hr/>以上题主举的四个污染物都回答了哦~题主还说了等，核酸提取中当然还少不了EDTA和乙醇的污染啦，详细的解答看这篇吧~
超详细Nanodrop结果判读！（中）

同花顺

具体怎样影响不好说，主要是这些残留物对于下游PCR存在影响，如果DNA模板残留物较多，加入到PCR buffer中，就会改变buffer中的某些物质作用的条件，比如盐类残留，就会改变buffer本身的盐浓度，甚至改变PH值，PCR所需条件就会被破坏。