关于荧光原位杂交技术（FISH）和探针设计

病理医师

• 荧光原位杂交技术（FISH）的发展史
  

荧光原位杂交技术是在同位素原位杂交技术的基础上发展起来的。
1969年Gall和Pardue及John等分别独立建立了同位素原位杂交技术。
1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。
1975年，Manning等人最先在溶液的分子杂交中，使用非放射性标记，通过细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。
1977年Rudkin等发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术。
1981年Bauman首次报道了采用荧光素标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术。
FISH技术发展至今已40多年，一直是细胞学研究的重要手段。自1990年以来，FISH在方法上形成了从一种颜色到多种颜色、从中期染色体FISH到粗线染色体FISH再到纤维-FISH的发展趋势，并且随着物理、化学技术的发展与进步，免疫染色、量子点和微流控芯片等不断被引入到荧光原位杂交中，促进了荧光原位杂交技术和分子细胞遗传学的发展。目前荧光原位杂交技术因其安全、准确、方便、实用等优点得到了广泛的关注及应用。


2. 荧光原位杂交技术（FISH）的定义
荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用荧光信号检测探针的原位杂交技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来，通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交。在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。


3. 荧光原位杂交技术（FISH）的原理
利用DNA探针与目标DNA序列进行亲和性结合，并通过荧光染料标记的探针来可视化目标DNA序列的位置和数量。FISH分为直接法和间接法。直接法是在已知碱基序列的核酸探针上标记荧光素，在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行原位杂交。因所形成的杂交体带有荧光素。故可在荧光显微镜下直接观察。间接法使用非荧光物质标记的核酸探针。如生物素或地高辛等标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入荧光物质来检测杂交体的存在。广义上讲，FISH靶序列可以是DNA或RNA，既可以用来进行基因组层面的研究，也可以进行表达层面的研究。目前常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明及其衍生物四甲基异硫氰酸罗丹明等。
4. 荧光原位杂交技术（FISH）的步骤

• 制备探针：首先需要设计和制备与目标DNA序列互补的DNA探针。探针通常是通过合成DNA序列并标记荧光染料来制备的。
  
• 处理样本：将待检测的细胞或组织样本进行固定和裂解处理，以使DNA序列暴露在外。
  
• 杂交：将标记有荧光染料的DNA探针与样本中的DNA序列进行杂交。探针与目标DNA序列互补结合后，形成探针-目标DNA复合物。
  
• 洗涤：对样本进行洗涤，以去除未结合的探针。
  
• 可视化：利用荧光显微镜或其他荧光成像设备观察样本。荧光染料的发光信号将显示出目标DNA序列的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的检测和定位。
  

5. 荧光原位探针制备
（1）荧光原位杂交所用的探针主要分为三类：
a. 染色体特异重复序列探针，例如 α 卫星、卫星 III类的探针，其杂交靶位常大于 1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；
b. 全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；
c. 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。


资源链接：http://www.ifish4u.org/
（2）荧光原位杂技探针制备和应用
设计FISH探针需要考虑以下几个步骤：
1. 目标序列选择：确定您要检测的目标序列。这可以是某个基因、染色体区域或其他感兴趣的核酸序列。
2. 探针设计：根据目标序列设计FISH探针。通常使用DNA或RNA探针，其长度通常在15到30个碱基对之间。
a. 序列设计：选择与目标序列互补的序列片段作为探针的序列。确保探针的序列选择合适，能够与目标序列高度特异性地杂交。
b. 标记物选择：选择适当的荧光标记物，如荧光染料或荧光素，用于标记探针。确保所选标记物在实验条件下有较好的稳定性和亮度。
3. 探针标记：将所设计的探针进行标记，使其能够通过荧光显微镜观察。这可以通过直接标记或间接标记的方法实现。
a. 直接标记：直接将荧光染料或荧光素与探针进行共轭。这通常需要具有适当官能团的标记物和探针。
b. 间接标记：首先将标记物与探针的亲和性结合，例如使用亲和标记物如生物素和荧光素的结合，然后通过辅助试剂（如荧光素标记的亲和物）将标记物引入样品中。
4. 验证和优化：对设计的FISH探针进行验证和优化。这包括进行探针的特异性和敏感性测试，并进行相关实验条件的优化。
资源链接：荧光原位杂交（FISH）探针的制备及其应用 - 实验方法 - 丁香通
6. 荧光原位杂交技术（FISH）的应用
（1）荧光原位杂交技术在肿瘤诊断中的应用
肿瘤已经成为现代人类死亡的主要原因之一，肿瘤的提前确诊对治疗有着极大的帮助。过去诊断细胞样本中是否含有肿瘤细胞主要用巴氏染色法等一些细胞化学染色法。新涌现的辅助诊断技术相比过去的方法更快捷简单，荧光原位杂交技术就是其中之一。
a. 血液肿瘤学。临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在：染色体异位形成的融合基因的检测；基因缺失检测可以发现一些关键基因的缺失，有助于疾病的诊断及预后判断；使用荧光原位杂交技术可对微小残留病灶进行检测，以及进行造血干细胞移植状态的监测。
b. 实体肿瘤学。目前应用于临床的检测基因突变方法以NGS和PCR为主。与FISH相比，NGS对实验室要求高，同时存在检测周期长和检测费用高等问题；荧光PCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量，无法做到绝对定量，数字PCR的检测系统成本高，通量有限，操作繁琐，也不能在细胞水平上观察到基因突变的状态，不具备定位的功能。FISH技术可以在间期细胞核上找到DNA扩增的直接证据，而且间期细胞核所显示出的扩增DNA荧光信号的数量多少及荧光强度常与DNA扩增的水平有关。
FISH被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌，宫颈癌，肺癌和淋巴癌等实体肿瘤的辅助诊断。目前，FISH主要集中用于对肿瘤的早期诊断、疗效检测，个体化治疗和预后判断等方面。
（2）基因定位是荧光原位杂交的最基础最成功的应用。
利用荧光原位杂交灵敏、准确，并且可以一次检测多段基因等特点，可以确定目标基因的准确位置，确定几个基因之间的位置关系，以及基因与染色体端粒之间的关系，基因与着丝点的关系，是构建基因图谱的基本要素。目前荧光原位杂交技术被广泛地应用于基因的物理定位及基因图谱的绘制。
（3）荧光原位杂交技术在产前检查中的应用
产前诊断是优生优育的重要保障。染色体异常是评价重大出生缺陷性疾病的重要指标。最常见的染色体异常是染色体数目异常，可能引发死胎、流产，即使存活也会使患病儿童畸形、生长缓慢、智力低下等。利用荧光原位杂交技术可以检测染色体非整倍体的特点，采集孕妇羊水，对未培养的羊水间期细胞进行检测，确定其是否为非整倍体，对胎儿染色体异常疾病进行诊断，使产前诊断时间缩短至24～48 h。荧光原位杂交的实验技术和探针的不断改进，应用荧光原位杂交方法进行产前诊断对一些重大染色体异常引起的疾病确诊率已经达到99%，相较于传统诊断方法更快捷，能够减少孕妇等待的痛苦。

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