微流控芯片/器官芯片的前景如何？

幸福侠侣

本人今年读研，本科专业为电子信息工程，主要做一些嵌入式开发。擅长电路设计，但是物理水平一般，流体力学基本没学。。。医学这些直接就一窍不通。现在很迷茫。
现在读研，导师的研究方向为器官芯片，不知道有没有业内大佬给点指点意见。

原文地址：https://www.zhihu.com/question/538687260

清风寡欲

大家好，今天我们来看看纳米医学研究文章——《Organ-on-chip systems as a model for nanomedicine》发表于《Nanoscale》。纳米医学为疾病治疗带来了新希望，但传统模型在临床转化方面存在不足。近年来，器官芯片系统逐渐兴起，为纳米医学研究提供了新途径。它能模拟组织、器官和疾病，帮助我们更好地研究纳米颗粒与生物系统的相互作用。接下来，我们将详细探讨器官芯片在纳米医学中的应用，包括评估纳米材料毒性、研究生物纳米颗粒、模拟生物屏障和建模癌症等方面。*本文只做阅读笔记分享*添加图片注释，不超过 140 字（可选）一、引言纳米医学为临床带来了许多成功的药物，但传统的模型系统在临床转化方面存在局限性，如细胞培养不能代表生理情况，动物模型与人的生理反应存在差异等。器官芯片（OoC）系统在过去十年中逐渐兴起，为纳米医学研究提供了新的模型，能够更好地模拟人体组织和器官的形态和功能。二、传统模型的局限性细胞培养模型：单细胞和二维的细胞培养不能反映体内多种细胞类型在复杂3D几何结构中的相互作用，导致药物临床试验失败率高。动物模型：小鼠、大鼠、斑马鱼、非人灵长类动物等动物模型已被用于评估纳米颗粒和药物的安全性和治疗效果。物种间的差异，特别是免疫反应和肿瘤微环境的差异，使得动物模型难以预测人体对纳米药物的反应。三、器官芯片（OoC）3.1 设计和制造设计原则：采用简化主义方法重现器官的基本解剖元素，通常包括组织生长隔间和营养物质运输通道。平台示例：堆叠的双通道设计较为常见，通道由半透多孔膜隔开，膜材料多为PDMS、PC或PET。制造材料：PDMS广泛使用，但具有疏水性和荧光信号；玻璃透明、生物相容，但透气性差、成本高；热塑性塑料生物相容、成本低，但透气性和结构刚性差。制造方法：软光刻成本效益高，可大量生产；3D打印用于快速原型制作；生物打印可制造人工器官，但分辨率低、时间长、材料有限。添加图片注释，不超过 140 字（可选）3.2 应用领域评估纳米材料毒性神经毒性-芯片：脑芯片中，表面修饰不同的量子点对PC12细胞的毒性不同，可精确控制细胞暴露部位，确定毒性作用位点。添加图片注释，不超过 140 字（可选）肺-芯片：肺芯片可评估TiO₂和ZnO NPs的毒性，如TiO₂-NPs在一定浓度下不影响肺泡-毛细血管屏障，而ZnO-NPs以剂量依赖方式影响细胞通透性；不同纳米颗粒与机械拉伸共同作用对肺芯片的影响不同。添加图片注释，不超过 140 字（可选）心脏-芯片：心脏芯片研究发现CuO和SiO₂纳米颗粒会影响心脏组织，CuO纳米颗粒产生ROS并导致心脏功能障碍，SiO₂纳米颗粒通过内皮细胞释放促炎细胞因子导致心脏毒性，内皮细胞通透性在暴露于CuO纳米颗粒时显著增加。添加图片注释，不超过 140 字（可选）肾脏-芯片：人类肾脏芯片可用于评估药物的肾清除率和重吸收，以及预测药物的肾毒性。添加图片注释，不超过 140 字（可选）多器官-芯片：多器官芯片可评估纳米毒性，如某芯片系统中，羧化聚苯乙烯NPs暴露后细胞活力未受影响，但天冬氨酸转氨酶（AST）水平升高。添加图片注释，不超过 140 字（可选）生物纳米颗粒病毒感染肠道：Caco2和HT-29细胞在肠道芯片平台上共培养，用于研究SARS-Cov-2病毒感染，病毒感染导致黏液层破坏和血管层变化，转录组分析显示细胞发生多种改变。另一个肠道芯片研究ACE2依赖性肠道NL63冠状病毒感染，揭示了一些药物的治疗效果和毒性效应，以及免疫细胞的作用。添加图片注释，不超过 140 字（可选）肺：肺芯片用于模拟肺泡生理学和冠状病毒感染，如研究SARS-Cov-2感染导致肺泡和内皮层感染，以及测试托珠单抗的效果；人类气道芯片用于研究不同株流感A病毒的感染和炎症反应，以及评估药物的效果。添加图片注释，不超过 140 字（可选）SARS-Cov-2伪病毒颗粒：在人类气道芯片和2D细胞培养中测试SARS-Cov-2伪病毒颗粒，发现部分药物在芯片中的效果与细胞培养中不同。添加图片注释，不超过 140 字（可选）细胞外囊泡（EVs）：肝脏-肾脏芯片用于研究乳腺癌EVs的器官趋向性，发现EVs在肝脏组织中积累更多，与体内结果一致，并确定了相关机制和潜在治疗方法。添加图片注释，不超过 140 字（可选）模拟生物屏障胎盘屏障-芯片：胎盘屏障芯片中，TiO₂纳米颗粒在不同浓度下对滋养层细胞和内皮细胞产生影响，随着纳米颗粒浓度增加，ROS产生和细胞死亡增加。添加图片注释，不超过 140 字（可选）血脑屏障-芯片血脑屏障结构模型：开发的血脑屏障结构芯片模型具有紧密的屏障完整性和类似于体内的渗透系数，可用于研究纳米颗粒的血脑屏障渗透和神经炎症、胶质增生等。GBM对BBB的影响模型：结合GBM肿瘤和BBB的微流控设备研究发现，非功能化的羧化聚苯乙烯NPs 无法绕过BBB，而功能化的AP2修饰的NPs在靠近GBM时渗透性增加，NP运输可能通过胞吞作用进行，该平台还可评估NPs的治疗效果。添加图片注释，不超过 140 字（可选）建模癌症NP 摄取早期研究：微流控设备评估 PEGylated 聚（乳酸）PLA NPs 和功能化微粒的靶向性，验证了靶向策略。添加图片注释，不超过 140 字（可选）肿瘤球体研究：不同大小的NPs在含有肿瘤球体的微流控设备中表现出不同的积累特性，非靶向NPs与PEG结合和与转铁蛋白结合的NPs在肿瘤球体中的积累情况不同。添加图片注释，不超过 140 字（可选）设备几何形状和驱动的影响：设备几何形状对NP摄取影响不显著，而负载甲氨蝶呤的脂质NPs比游离药物或空NPs更有效。添加图片注释，不超过 140 字（可选）浓度梯度和治疗效果：通过设备产生吉西他滨负载NPs的浓度梯度可导致细胞死亡沿类似梯度发生。添加图片注释，不超过 140 字（可选）肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）：微流控平台研究表明，负载紫杉醇的巨噬细胞可降低 SKOV3球体活力。添加图片注释，不超过 140 字（可选）中性粒细胞：微流控肿瘤-免疫微环境芯片研究发现，中性粒细胞在卵巢肿瘤模型中可导致中性粒细胞胞外陷阱的形成，有助于癌细胞侵入胶原基质。添加图片注释，不超过 140 字（可选）纳米基因递送系统：比较PPC和Express-in两种纳米基因递送系统，发现它们在设备中的运输和对 3D 肿瘤的转染情况不同。添加图片注释，不超过 140 字（可选）肿瘤血管早期研究：介孔二氧化硅NPs在微流控设备中可激活血小板，导致血小板粘附到血管上。3D血管化肿瘤模型：3D血管化肿瘤模型可用于研究肿瘤对化疗的反应，以及评估肿瘤血管生成和抑制的过程。肿瘤血管生成和抑制的评估：使用介孔二氧化硅NPs作为siRNA载体，在芯片上评估其对肿瘤血管生成的抑制作用，发现不同siRNA-NPs对HUVECs和成纤维细胞的血管生成抑制效果不同，对不同癌细胞系的作用也不同。添加图片注释，不超过 140 字（可选）其他治疗酸性条件和肿瘤生长：肿瘤芯片平台模拟酸性条件，发现CaCO₃ NPs可调节pH，抑制肿瘤生长，纳米CaCO₃可抑制癌症相关成纤维细胞导致的癌细胞迁移增加。磁性热疗（MHT）：GBM-芯片中，磁性NPs在交变磁场下可诱导热疗，抑制肿瘤生长。添加图片注释，不超过 140 字（可选）四、结论OoC系统为纳米医学提供了有价值的新工具，可用于纳米材料毒性评估、病毒和细胞外囊泡研究、生物屏障模拟和癌症建模等。它相对容易获取且多功能，能产生更模拟生理的生物模型，可减少动物模型的使用，产生更临床相关的结果并减少伦理问题，还能提供个性化模型以提供最佳治疗。未来需要开发更先进和互联的OoC平台，并集成传感器以监测生化变化，从而进一步推进个性化医疗。添加图片注释，不超过 140 字（可选）参考文献：Stavrou M, et al. Organ-on-chip systems as a model for nanomedicine. Nanoscale. 2023 Jun 15;15(23):9927-9940.
大家好，今天我们来看看纳米医学研究文章——《Organ-on-chip systems as a model for nanomedicine》发表于《Nanoscale》。纳米医学为疾病治疗带来了新希望，但传统模型在临床转化方面存在不足。近年来，器官芯片系统逐渐兴起，为纳米医学研究提供了新途径。它能模拟组织、器官和疾病，帮助我们更好地研究纳米颗粒与生物系统的相互作用。接下来，我们将详细探讨器官芯片在纳米医学中的应用，包括评估纳米材料毒性、研究生物纳米颗粒、模拟生物屏障和建模癌症等方面。
*本文只做阅读笔记分享*




一、引言
纳米医学为临床带来了许多成功的药物，但传统的模型系统在临床转化方面存在局限性，如细胞培养不能代表生理情况，动物模型与人的生理反应存在差异等。器官芯片（OoC）系统在过去十年中逐渐兴起，为纳米医学研究提供了新的模型，能够更好地模拟人体组织和器官的形态和功能。
二、传统模型的局限性
细胞培养模型：单细胞和二维的细胞培养不能反映体内多种细胞类型在复杂3D几何结构中的相互作用，导致药物临床试验失败率高。
动物模型：小鼠、大鼠、斑马鱼、非人灵长类动物等动物模型已被用于评估纳米颗粒和药物的安全性和治疗效果。物种间的差异，特别是免疫反应和肿瘤微环境的差异，使得动物模型难以预测人体对纳米药物的反应。
三、器官芯片（OoC）
3.1 设计和制造
设计原则：采用简化主义方法重现器官的基本解剖元素，通常包括组织生长隔间和营养物质运输通道。
平台示例：堆叠的双通道设计较为常见，通道由半透多孔膜隔开，膜材料多为PDMS、PC或PET。
制造材料：PDMS广泛使用，但具有疏水性和荧光信号；玻璃透明、生物相容，但透气性差、成本高；热塑性塑料生物相容、成本低，但透气性和结构刚性差。
制造方法：软光刻成本效益高，可大量生产；3D打印用于快速原型制作；生物打印可制造人工器官，但分辨率低、时间长、材料有限。




3.2 应用领域
评估纳米材料毒性
神经毒性-芯片：脑芯片中，表面修饰不同的量子点对PC12细胞的毒性不同，可精确控制细胞暴露部位，确定毒性作用位点。




肺-芯片：肺芯片可评估TiO₂和ZnO NPs的毒性，如TiO₂-NPs在一定浓度下不影响肺泡-毛细血管屏障，而ZnO-NPs以剂量依赖方式影响细胞通透性；不同纳米颗粒与机械拉伸共同作用对肺芯片的影响不同。




心脏-芯片：心脏芯片研究发现CuO和SiO₂纳米颗粒会影响心脏组织，CuO纳米颗粒产生ROS并导致心脏功能障碍，SiO₂纳米颗粒通过内皮细胞释放促炎细胞因子导致心脏毒性，内皮细胞通透性在暴露于CuO纳米颗粒时显著增加。




肾脏-芯片：人类肾脏芯片可用于评估药物的肾清除率和重吸收，以及预测药物的肾毒性。




多器官-芯片：多器官芯片可评估纳米毒性，如某芯片系统中，羧化聚苯乙烯NPs暴露后细胞活力未受影响，但天冬氨酸转氨酶（AST）水平升高。




生物纳米颗粒
病毒感染
肠道：Caco2和HT-29细胞在肠道芯片平台上共培养，用于研究SARS-Cov-2病毒感染，病毒感染导致黏液层破坏和血管层变化，转录组分析显示细胞发生多种改变。另一个肠道芯片研究ACE2依赖性肠道NL63冠状病毒感染，揭示了一些药物的治疗效果和毒性效应，以及免疫细胞的作用。




肺：肺芯片用于模拟肺泡生理学和冠状病毒感染，如研究SARS-Cov-2感染导致肺泡和内皮层感染，以及测试托珠单抗的效果；人类气道芯片用于研究不同株流感A病毒的感染和炎症反应，以及评估药物的效果。




SARS-Cov-2伪病毒颗粒：在人类气道芯片和2D细胞培养中测试SARS-Cov-2伪病毒颗粒，发现部分药物在芯片中的效果与细胞培养中不同。




细胞外囊泡（EVs）：肝脏-肾脏芯片用于研究乳腺癌EVs的器官趋向性，发现EVs在肝脏组织中积累更多，与体内结果一致，并确定了相关机制和潜在治疗方法。




模拟生物屏障
胎盘屏障-芯片：胎盘屏障芯片中，TiO₂纳米颗粒在不同浓度下对滋养层细胞和内皮细胞产生影响，随着纳米颗粒浓度增加，ROS产生和细胞死亡增加。




血脑屏障-芯片
血脑屏障结构模型：开发的血脑屏障结构芯片模型具有紧密的屏障完整性和类似于体内的渗透系数，可用于研究纳米颗粒的血脑屏障渗透和神经炎症、胶质增生等。GBM对BBB的影响模型：结合GBM肿瘤和BBB的微流控设备研究发现，非功能化的羧化聚苯乙烯NPs 无法绕过BBB，而功能化的AP2修饰的NPs在靠近GBM时渗透性增加，NP运输可能通过胞吞作用进行，该平台还可评估NPs的治疗效果。




建模癌症
NP 摄取
早期研究：微流控设备评估 PEGylated 聚（乳酸）PLA NPs 和功能化微粒的靶向性，验证了靶向策略。




肿瘤球体研究：不同大小的NPs在含有肿瘤球体的微流控设备中表现出不同的积累特性，非靶向NPs与PEG结合和与转铁蛋白结合的NPs在肿瘤球体中的积累情况不同。




设备几何形状和驱动的影响：设备几何形状对NP摄取影响不显著，而负载甲氨蝶呤的脂质NPs比游离药物或空NPs更有效。




浓度梯度和治疗效果：通过设备产生吉西他滨负载NPs的浓度梯度可导致细胞死亡沿类似梯度发生。




肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）：微流控平台研究表明，负载紫杉醇的巨噬细胞可降低 SKOV3球体活力。




中性粒细胞：微流控肿瘤-免疫微环境芯片研究发现，中性粒细胞在卵巢肿瘤模型中可导致中性粒细胞胞外陷阱的形成，有助于癌细胞侵入胶原基质。




纳米基因递送系统：比较PPC和Express-in两种纳米基因递送系统，发现它们在设备中的运输和对 3D 肿瘤的转染情况不同。




肿瘤血管
早期研究：介孔二氧化硅NPs在微流控设备中可激活血小板，导致血小板粘附到血管上。
3D血管化肿瘤模型：3D血管化肿瘤模型可用于研究肿瘤对化疗的反应，以及评估肿瘤血管生成和抑制的过程。
肿瘤血管生成和抑制的评估：使用介孔二氧化硅NPs作为siRNA载体，在芯片上评估其对肿瘤血管生成的抑制作用，发现不同siRNA-NPs对HUVECs和成纤维细胞的血管生成抑制效果不同，对不同癌细胞系的作用也不同。




其他治疗
酸性条件和肿瘤生长：肿瘤芯片平台模拟酸性条件，发现CaCO₃ NPs可调节pH，抑制肿瘤生长，纳米CaCO₃可抑制癌症相关成纤维细胞导致的癌细胞迁移增加。
磁性热疗（MHT）：GBM-芯片中，磁性NPs在交变磁场下可诱导热疗，抑制肿瘤生长。




四、结论
OoC系统为纳米医学提供了有价值的新工具，可用于纳米材料毒性评估、病毒和细胞外囊泡研究、生物屏障模拟和癌症建模等。它相对容易获取且多功能，能产生更模拟生理的生物模型，可减少动物模型的使用，产生更临床相关的结果并减少伦理问题，还能提供个性化模型以提供最佳治疗。未来需要开发更先进和互联的OoC平台，并集成传感器以监测生化变化，从而进一步推进个性化医疗。




参考文献：
Stavrou M, et al. Organ-on-chip systems as a model for nanomedicine. Nanoscale. 2023 Jun 15;15(23):9927-9940.

继续前进

​微流控技术应用于各个研究领域，包括器官芯片（OOC）系统。用于微流控的主要材料是聚二甲基硅氧烷（PDMS），这是一种有机硅弹性体材料，具有生物相容性、透明且易于用于具有明确微结构的OOC系统。然而，以 PDMS 为基础的 OOC 系统会吸收疏水性小分子，因此很难对此类化合物进行定量分析评估，甚至会出现错误。在本文中，我们探讨了如何使用一种具有出色 "不粘 "特性的合成含氟聚合物--聚(4,5-二氟-2,2-双(三氟甲基)-1,3-间二氧杂环戊烯-四氟乙烯)（Teflon AF 2400 富临塑胶供应Teflon AF 2400管材、粉末、溶液、薄膜）来对 OOC 系统进行功能化。包括大麻二酚（CBD）在内的大麻素是一类疏水性化合物，在治疗焦虑、抑郁、疼痛和癌症方面具有巨大潜力。通过使用 CBD 作为测试化合物，我们采用 LC-MS/MS 分析方法检测并系统地量化了 CBD 在 PDMS 中的吸收情况。与未改性的 PDMS 微通道相比，经过含氟聚合物表面改性的微通道在静态培养 3 小时后，CBD 信号增加了约 30 倍。在灌注条件下，我们观察到表面改性微通道的 CBD 信号比未改性微通道增加了近 15 倍。此外，我们还证明了氟聚合物改性微通道可用于培养 hCMEC/D3 内皮细胞和 CBD 灌注实验。



一、简介

在过去十年中，我们看到芯片上器官（OOC）技术领域取得了爆炸性进展。OOC 系统旨在复制人体或动物组织的对应特征，以测量原生器官的各种关键生理功能。这是通过控制细胞培养的微生理环境（如微流体结构）来实现的。微流体构建体采用各种生物相容性材料制成。已在 OOC 系统中广泛探索的人体重要器官对应物包括心脏、肝脏、皮肤、肾脏、肺、肠道和生物屏障等。事实证明，与 OOC 系统的单个模块单元测试相比，器官模拟的相互连接也具有优势，并能提供更准确的结果。例如，互联的多 OOC 系统有助于评估人体如何吸收、分布、代谢和排出药物（ADME）。报告了使用多 OOC 系统的情况，该系统由模仿循环系统（肺、肝、脂肪组织和其他组织）的四个腔室组成的流体网络构成，用于测试替加氟等几种药物的代谢依赖性毒性。此外，OOC 技术还能开发不同的人类疾病模型，如神经系统疾病。这些 OOC 系统还可以集成为生物传感器或诊断工具，用于疾病管理，例如利用芯片上的 SARS-CoV-2 进行长期的 COVID 管理。毫不奇怪，由于其在药物发现领域的潜在变革能力，OOC 技术已经引起了巨大的商业兴趣，最近还出现了一些初创公司，如 Emulate™ 和 Hesperos™。

自 OOC 技术领域诞生以来，PDMS 一直是 OOC 设备的常用材料。PDMS 具有几个重要的关键特性，使其至今仍是 OOC 器件的首选材料。使用 PDMS 的优势包括：成本相对较低；高弹性，可实现出色的芯片操作；光学透明性，适合细胞成像；高气体渗透性；生物相容性，适合长期细胞培养。在设备制造方面，PDMS 可以制造柔性膜和微通道，并能以高分辨率适应各种拓扑结构。尽管 PDMS 是构建 OOC 设备最常用的材料之一，但 PDMS 也有一些固有的缺点需要克服。例如，如果 PDMS 单体在制造过程中没有完全固化，未固化的低聚物就会从聚合物网络中渗入微通道介质，从而对细胞培养产生毒性。另一个重要的缺点是 PDMS 材料的疏水性，这会导致大量吸收疏水小分子，包括细胞培养基中的成分和 OOC 系统中细胞-药物相互作用研究中评估的测试化合物中的成分。因此，使用基于 PDMS 的 OOC 设备会导致得出不正确的 ADME 值。

因此，最近人们探索了各种 PDMS 表面改性策略，以提高其实用性并扩大其在 OOC 中的应用。例如，通过氧等离子体处理，PDMS 表面可以暂时从疏水性转变为亲水性。通过物理吸附进行表面改性在实验上既简单又快捷。例如，在 PDMS 表面实现了三嵌段共聚物聚乙氧基（POE）-聚氧丙烯（POP）-POE（Pluronic F108）的物理吸附。F108 的疏水性 POP 部分附着在疏水性 PDMS 表面，而亲水性 POE 部分则暴露在溶液中。然而，表面与表面改性剂之间的微弱相互作用会导致热和机械不稳定性。另一方面，化学修饰（如硅烷功能化）可以提供长期稳定性，并获得更好的表面坚固性。报道了一种用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）和戊二醛交联修饰 PDMS 表面的方法，以降低 PDMS 疏水性并增加蛋白质固定。

其他替代材料，如海藻酸盐、热塑性塑料、陶瓷和树脂，也被积极测试是否适合 OOC 应用。特别是报道了完全由特氟龙材料制成的微流控芯片的使用情况，这种芯片不会吸收小分子，也不会沥滤残留分子。然而，这种特氟龙芯片的制造过程需要使用热压纹技术，温度要求较高，无法达到与 PDMS 材料相同的高分辨率。总之，上述表面功能化技术通常需要几个复杂的改性步骤，而且其他替代材料也不具备与 PDMS 材料相同的高度理想特性。因此，我们非常希望对 PDMS 进行简便的表面改性，这样既能获得高疏水化合物回收率，又能使涂层具有 "惰性"。

大麻素，如大麻二酚（CBD）和Δ9-四氢大麻酚（THC），是高度疏水性化合物，很容易分布到脂肪组织和其他活性表面。越来越多的临床前模型和临床研究对大麻及其衍生物进行研究，以治疗一系列疾病。例如，大麻素已在癌症患者中试用，并显示出一些有希望的临床前数据，表明它们具有作为抗癌剂的潜力。大麻素还在小儿癫痫、神经性疼痛和多发性硬化等领域进行了探索。精神活性低于四氢大麻酚的 CBD 和其他大麻素已作为镇痛、消炎、抗皱和保湿剂商业化。此外，还在探索使用 CBD 治疗皮肤病和促进头发再生。

筛选 CBD 和其他大麻素对不同类型疾病的初步疗效的常见做法仍然严重依赖于使用基于动物的体内模型或传统的孔板细胞培养方法。由于不同物种之间的固有差异和二维细胞培养的简易性，传统的药物测试方法被认为是低效的。"人源化 "OOC 系统可以成为测试药物疗效的下一个黄金标准。尽管最近在医疗环境中使用大麻素很流行，但就我们所知，我们还没有看到任何关于在 OOC 系统中测试大麻素的报告。疏水性化合物（如大麻素）在基于 PDMS 的 OOC 中的吸收问题亟待解决。此外，改善微流控系统在输送大麻素方面的适用性的方法也可能对多种亲脂性药物有益。

在本文中，我们展示了一种简单的一步功能化方法，即在 PDMS 表面钝化一薄层含氟聚合物 Teflon AF 2400。比较了含氟聚合物和不含氟聚合物的 PDMS 平面和微流体通道对 CBD 的吸收情况。采用偶氮偶联衍生化方法对 CBD 进行后收集，以提高 CBD 在 LC-MS/MS 中的检测限。最后，在 PDMS 微通道中培养了人内皮细胞 hCMEC/D3，以测试Teflon AF 2400 涂层表面的生物相容性。结合 hCMEC/D3 细胞单层，涂有含氟聚合物的微通道对 CBD 的检测灵敏度是未改性微通道的八倍。这种简单、一步完成的微流控通道PDMS表面改性技术可用于OOC应用，以提高疏水性化合物的回收率。（东莞市富临塑胶原料有限公司供应Teflon AF 2400管材、粉末、溶液、薄膜）


二、材料与方法

2.1. 化学品
甲酸铵、醋酸铵、Fast Red RC 盐、甲酸、用于 LC-MS 的甲醇超标品、六甲基二硅氮烷和聚[4,5-二氟-2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-四氟乙烯]（Teflon™ AF 2400购自东莞市富临塑胶原料有限公司）。Fluorinert FC-72（Alachua, FL, USA）。


2.2. 基于 PDMS 的微流体通道制造
如前所述，PDMS 的母模是通过标准的软光刻技术制作的。首先，使用丙酮和异丙醇清洗硅晶片，并在 200℃ 温度下预烘烤 2 分钟。为了达到 125 微米的高度，使用 Karl Suss Delta 80 旋转涂布机在 2000 转/分钟的转速下将光刻胶 SU-8 50 旋转到硅片上 30 秒。然后使用 EVG 620 掩膜对准器将涂有 SU-8 50 的硅晶片暴露在 350 mJ/cm2 的紫外线下。然后在 65℃ 下烘烤 2 分钟，在 95℃ 下烘烤 8 分钟。图案使用丙二醇甲醚醋酸酯显影，然后分别在 65℃、95℃ 和 130℃下烘烤 1、3 和 10 分钟。最后，在 130℃的真空干燥器中用六甲基二硅氮烷处理 SU-8 图形硅片 30 分钟。

在制作基于 PDMS 的微流控装置时，将聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂以 10:1 的比例充分混合，然后倒入 SU-8 型硅晶片上，并在真空下脱气。为了制备平整的 PDMS 片材，将 PDMS 预聚物和催化剂的混合物倒入培养皿中，并在真空下脱气。然后将 PDMS 在 80℃ 的烘箱中固化 4 小时，再用手术刀切割，最后剥离。使用直径为 1.5 毫米的 Harris Uni-Core 穿刺器打出入口和出口。完成的 PDMS 通道先在乙醇中超声清洗，然后用 40 秒氧等离子清洗器不可逆地粘合到玻璃盖玻片上，形成微流控器件。最后，在 80℃ 下热处理 10 分钟，以获得永久粘合。平整的 PDMS 片直接从培养皿中剪下，使用前在乙醇中超声清洗。


2.3. 在平整的 PDMS 表面和微通道上涂覆Teflon AF 2400
将聚Teflon AF 2400 粒子溶解在 Fluorinert FC-72 中，得到 2% 的初始储备浓度，并在超声波水浴（Elma S60，德国辛根）中进行超声处理以帮助溶解。然后用 Fluorinert FC-72 将储备液进一步稀释至 1%和 0.5%。用移液管将 20 µL 不同浓度（2%、1%、0.5% 和 0%）的 Teflon AF 2400 溶液吸到平整的 PDMS 片上，然后在 80℃ 的烘箱中培养 30 分钟。同样，用移液管将 10 µL 的Teflon AF 2400 溶液（1%）注入微流体通道，然后放入 80℃ 的烘箱中培养 30 分钟。用 Fluorinert FC-72 溶剂清洗涂有涂层的 PDMS 平板和微流体通道，然后再次放入烘箱中干燥 15 分钟。（富临塑胶供应Teflon AF 2400管材、粉末、溶液、薄膜）


2.4. 水接触角 (WCA) 测量
本研究使用光学张力计（KSV CAM 200）在 25℃下测量 PDMS 表面的 WCA。在未涂覆的 PDMS 表面和涂覆了 Teflon AF 2400 的 PDMS 表面小心滴入约 3 μL 的 Milli-Q 水。采集图像，并通过内置软件根据采集的图像自动计算 WCA 值。所有测量至少重复三次，并取平均值。


2.5. 衰减全反射-傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）
使用 Thermo Scientific Nicolet 6700 获得了未涂层 PDMS 表面和涂有 Teflon AF 2400 的 PDMS 表面的 ATR-FTIR 光谱。在 ATR 配置中使用了一个 2 毫米的金刚石晶体和一个氘化硫酸三甘氨酸检测器。采集的光谱是 64 次扫描的平均值，分辨率为 8 cm^(-1)。背景光谱用空气消隐。数据使用 OMNIC 软件进行处理。


2.6. X 射线光电子能谱 (XPS)
XPS 分析用于确认氟聚合物改性 PDMS 的表面化学性质。XPS 分析是使用 AXIS Nova 光谱仪进行的，该光谱仪配备单色 Al Kα 源，功率为 180 W（15 kV × 12 mA），半球形分析仪在固定分析仪透射模式下工作，具有标准孔径（分析区域：0.3 mm × 0.7 mm）。分析期间，主室的总压力通常在 10^(-9) 和 10^(-8) 毫巴之间。测量光谱是在 160 eV 的通过能量下获得的。样品被填充到定制样品支架的浅井中，并在与表面法线成 0° 的标称光电子发射角下进行分析。

数据处理采用 CasaXPS 软件 2.3.15 版。所有存在的元素都是从调查光谱中识别出来的。使用积分峰强度和制造商提供的灵敏度系数计算检测到的元素的原子浓度。结合能以 285.0 eV 的 C 1s 峰（脂肪烃）为参照。


2.7. 在平整的 PDMS 和微流控通道内培养 CBD
将 CBD 粉末溶解在 DMSO 中，浓度为 10 mg/mL，然后用 Milli-Q 水进一步稀释至 1 µg/mL。在细胞培养箱（37℃）内，取 10 µL CBD（1 µg/mL），在涂有 Teflon AF 2400 的 PDMS 平板上培养 3 小时。在测试 CBD 被微流控通道吸收的情况下，将 10 µL 1 µg/mL 的 CBD 手动注入微通道并在 37℃ 下培养 3 小时。微通道的入口和出口用胶带封住，以防蒸发。然后收集微通道内的 CBD 溶液，通过 LC-MS/MS 进行分析。在选定的实验中，使用注射泵将 CBD 溶液注入涂有或未涂Teflon AF 2400 的微通道。在选定的实验中，使用聚丙烯制成的一次性塑料注射器和 Tygon™ ND-100-80 管进行灌注，以测试 CBD 在塑料表面的吸附情况，灌注时间为 3 小时。在本文介绍的大多数灌流实验中，使用的是玻璃注射器和聚醚醚酮（PEEK）聚合物管。收集 10 µL 的洗脱液样品，然后进行衍生化和 LC-MS/MS 分析。


2.8. CBD 衍生化和 LC-MS/MS 分析
对 CBD 进行衍生处理是为了提高 CBD 的电离效率，从而提高检测 CBD 的灵敏度。将 Fast Red RC 溶于乙酸铵（5 mM）中，浓度为 100 µg/mL。从平整的 PDMS 和微流控通道内收集的 CBD 样品（10 µL）与快速红溶液按 1:1 的比例混合，装入玻璃瓶中，培养 10 分钟，形成偶氮偶联衍生 CBD，然后注入岛津三重四极杆 LC-MS/MS（岛津 8050）进行分析。请注意，为了确保 CBD 样品完全衍生化，使用了过量摩尔比的衍生剂。

流动相 A 由 5.0 mM 甲酸铵和 0.05% 甲酸组成，流动相 B 由 LC-MS 级甲醇和 0.05% 甲酸组成。流动相 B 由 LC-MS 级甲醇和 0.05% 的甲酸组成。色谱采用 Ascentis® C18 HPLC 色谱柱，粒径为 3 µm（15 cm × 2.1 mm）。采用以下梯度洗脱：进样量为 2 µL，流速为 0.50 mL/min，色谱柱温度保持在 40℃。为消除携带，针头冲洗浸泡时间为 30 秒。质谱条件如下 ESI 源为正离子模式，界面电压为 2 kV，界面温度为 300℃，雾化气体（N2）流量为 2 L/min，DL 温度为 250℃，热阻温度为 400℃，干燥气体（空气）流量为 10 L/min。衍生化 CBD 的多反应监测（MRM）跃迁如下：m/z 483.10 → 157（碰撞能 -35.0 V），m/z 483.10 → 270.3（碰撞能 -25.0 V）。总离子色谱图（TIC）由这两个主要跃迁相加而成，TIC 曲线下的面积用于定量衍生 CBD 的含量。在典型的 LC-MS 分析中，其中一个跃迁将用作定量器，另一个跃迁将用作定性器。不过，由于我们的样品足够干净（CBD 直接溶解在水溶液中，而不是复杂的基质中），因此使用 TIC 作为定量器是合理的，而且定量的灵敏度更高。


2.9. 涂覆和不涂覆 Teflon AF 2400 的微通道中的 hCMEC/D3 细胞培养
如前所述，将永生化人脑微血管内皮细胞系培养在含有补充生长因子的生长基础培养基-2中。hCMEC/D3 细胞在涂有胶原蛋白-I（10 μg/mL，大鼠尾，Sigma-Aldrich）的组织培养瓶中培养。达到汇合后，使用 Accutase™ 细胞解离试剂将 hCMEC/D3 细胞从烧瓶中解离，以进行后续维护并接种到微通道中。

将涂有或未涂有 1% Teflon AF 2400 的微通道与 1:10 稀释的基质胶溶液一起孵育过夜。将 hCMEC/D3 细胞从细胞培养瓶中分离出来，以 1 × 106 个细胞/mL 的浓度重悬于培养基中，并将细胞悬液注射到微流道中。细胞在培养箱（5% CO2 和 37 °C）内培养 2 天，然后在流动下进行免疫染色或 CBD 处理。将配备玻璃注射器和 PEEK 管的注射泵连接到细胞通道，并以 2 μL/min 的速度灌注 CBD 溶液 (1 μg/mL) 3 小时。实验完成后，收集洗脱液，并对收集的 CBD 溶液 10 μL 进行衍生化并通过 LC-MS/MS 进行分析。


2.10. 细胞染色
将 hCMEC/D3 细胞在微流控通道（有Teflon AF 2400 涂层和无Teflon AF 2400 涂层）内培养 2 天，然后用 PBS 冲洗细胞，并用 4% 甲醛在 PBS 中固定 10 分钟。然后用 PBS 冲洗细胞三次，再用 Triton X-100 溶液（0.1%）通透细胞 10 分钟。然后用 PBS 冲洗细胞，再用 SP8 共聚焦显微镜进行成像分析。（东莞市富临塑胶原料有限公司供应Teflon AF 2400管）


2.11. 数据分析
除非另有说明，所有报告数据均为一式三份（N = 3）。使用 Prism V9.5.1 进行学生 t 检验以比较各条件之间的统计学意义，并使用 Prism V9.5.1 生成图表。


三、结果与讨论

将 PDMS 用作微流控芯片的构建材料，尤其是用于 OOC 应用，起到了重要作用；然而，小分子（尤其是疏水性药物化合物）对 PDMS 的吸收阻碍了 PDMS 的广泛应用。我们探索使用 Teflon AF 2400 含氟聚合物钝化微流体通道表面，以防止小分子结合（图 1）。经过 30 分钟的培养，含氟聚合物在 PDMS 表面形成了一层类似特氟龙的薄层。CBD 是一种高度疏水的大麻类化合物，我们用它来量化经过和未经过表面改性的微流控通道对疏水化合物的吸收程度（图 1）。我们首先进行了一系列表面表征技术，以确认 PDMS 表面已成功改性。然后利用 LC-MS/MS 技术对未修饰微通道和特氟龙修饰微通道上的 CBD 吸收情况进行量化和比较。为了将这种表面改性应用于 OOC 系统，我们进一步验证了这些表面改性微通道可以支持哺乳动物细胞生长，作为更复杂的 OOC 测试的 "前体"。




图 1. CBD 扩散和吸收到基于 PDMS 的微流控芯片系统中的示意图。 当微流体通道用聚[4,5-二氟-2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环戊烯-四氟乙烯] (Teflon™ AF 2400) 钝化时，PDMS 中 CBD 的吸收会减少。 TeAF：Teflon™ AF 2400。


3.1. 表面表征确认聚四氟乙烯 AF 2400 在 PDMS 表面的涂层
我们首先使用平整的 PDMS 表面来确认含氟聚合物的表面功能化。将 1% Teflon AF 2400 溶液放在 80℃ 的烘箱中在平整的 PDMS 片材上孵育 30 分钟后，我们可以目测到在 PDMS 表面形成了一层薄薄的涂层，因为涂有聚四氟乙烯 AF 2400 的区域变得略微浑浊（图 2A）。在 ATR-FTIR 中，PDMS 可通过其特征吸收带识别，如 2960 cm^(-1) 处的 C-H 伸展、1252 cm^(-1) 处的 Si-CH3 的 CH3 对称弯曲、1063 和 999 cm^(-1) 处的 Si-O 带，以及 780 cm^(-1) 处属于 Si-CH3 中 CH3 摇晃的峰。镀膜后，明显出现了Teflon AF 2400 的新峰，如 1124 cm^(-1) 处的 C-F 不对称伸展和 1074 cm^(-1) 处的 C-F 对称伸展（图 2B）。XPS 分析进一步证实了这一点，在涂覆后测得 55.1 原子%的氟，而在 PDMS 中未检测到氟（表 1）。此外，还对经过和未经过表面改性的 PDMS 进行了水接触角测量（图 2C）。通常，水接触角小于 90° 的表面被视为亲水表面，而水接触角大于 90° 的表面则被视为疏水表面。测量结果显示，未改性的 PDMS 表面的接触角为 112.1° ± 1.1°（图 2C）。这一测量结果与之前的报告一致，PDMS 的水接触角为 108° ± 7°。用 1% 聚四氟乙烯 AF 2400 培养 PDMS 表面后，水接触角略微增加到 118.1°± 2.6°（图 2C）。这进一步证实了 PDMS 表面已成功改性。




表 1. 通过 XPS 测定的 PDMS 和涂有 Teflon AF 2400 的 PDMS 的原子百分比 (N = 3)。




图 2. 使用和不使用 Teflon AF 2400 功能化的 PDMS 的表面特征。(A) 1% Teflon AF 2400 液滴 (20 µL) 在 PDMS 上于 80℃ 孵育 30 分钟的照片。 可以观察到可见的斑点（~5 毫米）。 (B) 裸露 PDMS 和涂有 Teflon AF 2400 的 PDMS 的 ATR-FTIR 光谱。(C) 裸露 PDMS（上）和涂有 Teflon AF 2400 的 PDMS（下）的水接触角代表性图像。（东莞市富临塑胶原料有限公司供应Teflon AF 2400管材、粉末、溶液、薄膜）


3.2. 偶氮偶联衍生化方法提高了 CBD 的定量限
由于 CBD 是一种高度疏水性且电离性较差的化合物，使用标准的 LC-MS 方法，从微流体通道中回收的 CBD 会远远低于检测限。衍生化方法可以显著提高芳香族化合物的电离效率，从而提高从微流道回收的少量 CBD 的检测灵敏度。Luo 及其同事首次报道了基于偶氮偶联的四氢大麻酚及其他芳香族化合物衍生化方法。该方法验证了四氢大麻酚衍生化检测，定量限（LOQ）为 0.50 pg/mL。在本研究中，我们也采用偶氮偶联法对 CBD 进行衍生，以增强 CBD 信号。事实上，CBD 和 THC 的结构非常相似。同样，用 Fast Red RC 对 CBD 进行衍生也是在室温下进行的（图 3A）。生成的衍生 CBD 校准曲线显示出高度线性相关（图 3B）。此外，由于采用了衍生化方法，在进样 2 µL 时，我们能够检测到的最低 CBD 浓度（LOQ）为 0.1 pg/mL（图 3C）。




图 3.(A) CBD 和固红 RC 之间的偶氮偶联，形成衍生化 CBD。收集后进行衍生化步骤。(B) 衍生化 CBD (1 µg/mL) 在 3.86 分钟时解析的代表性离子色谱图。插入显示线性拟合校准曲线。(C) 使用衍生化方法实现了 0.1 pg/mL 的 LOQ。


3.3. 通过Teflon AF 2400 功能化的平整 PDMS 表面减少了对 CBD 的吸收
我们首先研究了不同浓度的Teflon AF 2400（从 0% 到 2% 不等）改性后的平整 PDMS 表面对 CBD 的吸收程度。为此，在涂有聚四氟乙烯 AF 2400 的 PDMS 表面和对照裸 PDMS 表面静置培养 10 µL 1 µg/mL 的 CBD。实验结束后收集 CBD 溶液并进行衍生处理。对于未进行表面改性的裸 PDMS，CBD 通过吸收进入 PDMS 而大量流失（图 4A），LC-MS/MS 只能检测到一个较弱的峰值（图 4B）。另一方面，当用 0.5% 聚四氟乙烯 AF 2400 修饰 PDMS 表面时，我们发现信号强度增加了约 20 倍（图 4）。当含氟聚合物浓度增加到 1%时，CBD 检测灵敏度增加了 60 倍（图 4）。然而，当含氟聚合物的浓度增加到 2% 时，CBD 信号没有进一步增加，这表明 PDMS 表面的Teflon AF 2400 涂层可能已经达到饱和状态（图 4）。事实上，在选定的表面上还测试了从 0.1 μg/mL 到 10 μg/mL 的 CBD 浓度范围（数据未显示）。然而，在测试高浓度 CBD（10 μg/mL）时，LC-MS/MS 的输出信号达到饱和，这将导致进一步的分析不准确。另一方面，在较低的 CBD 浓度（0.1 μg/mL）下，CBD 在未改性的 PDMS 上孵育时大部分被吸收，LC-MS/MS 输出信号大部分减弱为背景信号，很难进一步与其他表面改性进行比较。因此，我们选择了 1 μg/mL 作为最理想的模型浓度，用于测试不同表面修饰对 CBD 的吸收程度。




图 4. 用不同浓度的 Teflon AF 2400 处理的扁平 PDMS 中 CBD 的吸收。(A) 将 CBD 以 1 µg/mL 孵育 3 小时后的 CBD 信号比较，并通过 LC-MS/MS 进行分析。ns，没有显着差异（p > 0.05）；***，p < 0.001 (B) Teflon AF 2400 每种表面涂层的代表性离子色谱图（0%、0.5%、1% 和 2%）。


3.4. 玻璃注射器和 PEEK 管的组合提高了流动条件下的 CBD 回收率
在微流控研究领域，使用泵设备（如注射泵、蠕动泵、气动泵或压力驱动泵）将液体从外部储液器输送到微流控芯片中是一种常见的方法。注射泵可能是使用较广泛的泵系统，因为它易于安装，而且比其他泵系统便宜。在典型的注射泵驱动实验中，注射器通常装有相关液体（如测试药物），并通过连接管与微流控芯片相连。聚丙烯制成的一次性塑料注射器和 Tygon 塑料管也是非常常见的选择。不过，也有报道称，一些实验室塑料材料会无意中吸收某些测试化合物。由于 CBD 是一种非常疏水性的化合物，我们想验证常用的液体输送装置（即聚丙烯注射器和塑料 Tygon 管）是否适用于这种用途。灌注 3 小时后，我们将 CBD 装入一次性聚丙烯塑料注射器并用塑料泰贡管连接，量化了 CBD 的损失程度。令人惊讶的是，我们观察到 CBD 在聚丙烯塑料注射器/泰贡管輸送系统中几乎完全损失（图 5）。然后，我们使用玻璃注射器和聚醚醚酮（PEEK）管进行了完全相同的实验，以连接玻璃注射器和微流控芯片。事实上，PEEK 管是一种热塑性聚合物，对大多数溶剂具有化学惰性，已成为许多高效液相色谱系统的标准配置。与使用一次性聚丙烯塑料注射器/Tygon 软管的输送系统相比，我们观察到，当使用玻璃注射器和 PEEK 软管组合时，从收集的洗脱液中得到的 CBD 信号的灵敏度显著提高（图 5），我们观察到一个尖锐而强烈的峰值（玻璃注射器 + PEEK 软管），而使用聚丙烯塑料注射器和 Tygon 软管时则是一个接近背景噪声的峰值（图 5B）。因此，在接下来的所有实验中，我们都使用玻璃注射器和 PEEK 管组合在微流体通道中输送 CBD。




图 5. 不同交付设置的 CBD 回收率比较。(A) 与玻璃注射器/PEEK 管设置相比，塑料聚丙烯注射器和 Tygon 管输送设置的 CBD 损失显着。***，p < 0.001。(B) 每个传输设置的代表性离子色谱图。（N = 3）。


3.5. 通过Teflon AF 2400 功能化的微流控通道提高了 CBD 的吸收率
然后，我们用Teflon AF 2400 对表面改性的微流控通道进行了 CBD 吸收的定量分析。我们首先比较了未经改性的微通道和用 1% Teflon AF 2400 改性的微通道在静态培养 CBD 的情况下的吸收情况，因为有些 OOC 系统更适合在静态条件下进行细胞培养。有趣的是，与裸露的 PDMS 通道相比，我们从表面修饰的微通道中检测到的 CBD 信号增加了 35 倍（图 6A）。之前在用 1% Teflon AF 2400 修饰的平面 PDMS 上也观察到了类似的趋势（图 4A）。（东莞市富临塑胶原料有限公司供应Teflon AF 2400管材、粉末、溶液、薄膜）




图 6. 未处理的微通道和经 1% Teflon AF 2400 处理的微通道中 CBD 吸收的量化。(A) 1 µg/mL CBD 在微通道内静态孵育 3 小时，或 (B) 使用注射泵通过微通道灌注 5 小时。 ***，p < 0.001。 每小时结束时通过 LC-MS/MS 对洗脱液浓度进行衍生和定量 (N = 3)。

此外，我们还使用玻璃注射器/PEEK 管组合作为输送装置，比较了经 Teflon AF 2400 修饰的 PDMS 微流体通道和未经修饰的 PDMS 微流体通道在流动条件下（2 µL/min ）的 CBD 回收率。从图 6B 中可以看出，在灌注 CBD 的第一个小时，用特氟龙 AF 2400 处理过的微通道与对照裸露 PDMS 微通道相比，灵敏度提高了约 10 倍。不出所料，CBD 灌注时间越长，微通道出口处检测到的 CBD 信号就越高（图 6B）。事实上，灌注 5 小时后，表面修饰通道的 CBD 信号达到了 CBD 标准的 70%，是未进行表面修饰的微通道信号的 15 倍（图 6B）。


3.6. Teflon AF 2400 功能化的微流体表面适合细胞实验
到目前为止，我们已经证明，使用Teflon AF 2400 功能化的 PDMS 表面（包括 PDMS 平面和 PDMS 微通道内部）在减少疏水性化合物（即 CBD）吸收方面的性能优于裸露的 PDMS 表面。这是将该技术推广到 OOC 系统，特别是药物发现分析应用的关键一步。下一步，我们要确保用Teflon AF 2400 修饰的微流体通道适合细胞培养，并确保这种修饰表面仍能支持正常的细胞生长和功能。这一步被视为实现功能性 OOC 系统的 "前奏"。我们利用 hCMEC/D3 细胞作为模型细胞系，测试这种功能化 PDMS 通道是否适合在芯片上培养哺乳动物细胞。培养结束后，用类黄素和 DAPI 染色观察到了相似的细胞形态（图 7A、B）。这表明Teflon AF 2400 涂层表面可以支持哺乳动物细胞的正常生长。通过扫描微流体通道的整个长度，我们观察到 hCMEC/D3 细胞均匀地分布在经 Teflon AF 2400 修饰的整个微通道上（图 7C）。最后，在培养有 hCMEC/D3 细胞的微通道上灌注 CBD 3 小时，表面修饰的微通道对 CBD 的敏感性比裸露的 PDMS 微通道高出近 8 倍（图 7D-F）。事实上，在芯片上培养 hCMEC/D3 细胞，尤其是紧密单层培养，是血脑屏障（BBB）研究的常用模型。这些芯片上的血脑屏障模型也正成为神经系统疾病和脑癌研究中常用的体外模型。尽管有报道称包括 CBD 在内的大麻素对治疗脑癌患者有益，但要彻底研究 CBD 作为抗癌剂的用途，仍有许多工作要做。我们相信，体外 OOC 系统方法，尤其是改进表面修饰以确保药物化合物定量不丢失的方法，有助于进一步了解 CBD 作为抗癌剂的作用机制。




图 7. CBD 化合物在 hCMEC/D3 细胞培养微通道上的形态评估和测试。D3 细胞在没有 1% Teflon AF 2400 表面修饰的微通道（A）和（B）有 1% Teflon AF 2400 表面修饰的微通道上培养。培养 2 天后，鬼笔环肽（绿色）和 DAPI（蓝色）对细胞形态进行染色。(C) 低倍放大显示涂有 1% Teflon AF 2400 的通道中均匀分布的细胞培养物（DAPI 染色细胞）的整个通道。比例尺：（A，B），50 µm；(C)，500 微米。(D) 将 1 µg/mL 的 CBD 灌注到未修饰的（对照）微通道和用 1% Teflon AF 2400 修饰的微通道上，与 hCMEC/D3 细胞一起培养 3 小时。使用 LC-MS/MS 收集并定量洗脱液。***，p < 0.001。代表对照 (E) 和涂有 1% Teflon AF 2400 (F) 的微通道与 hCMEC/D3 细胞 (N = 3) 培养的离子色谱图。


四、结论

本文报告了一种简单的一步法改性 PDMS 表面的方法，使用的材料在 OOC 平台中非常流行，特别是在药物发现方面。在此，我们建议使用 OOC 系统测试大麻素化合物，特别是 CBD，以对抗不同类型的疾病，因为大麻素的药用价值研究日益受到欢迎。对 CBD 在 OOC 平台中吸收情况的关键分析以及减少吸收的方法，为 OOC 在 CBD 测试中的广泛应用架起了桥梁。

我们用Teflon AF 2400 溶液对 PDMS 表面进行了钝化处理，以形成对 CBD 的非粘附层。我们发现，1% 的 Teflon AF 2400 是减少 CBD 吸收的有效浓度。此外，我们还证明了使用玻璃注射器和 PEEK 管组合作为流体泵送装置比使用塑料注射器和塑料管更能有效地减少流体输送过程中药物化合物的流失。与裸露的 PDMS 微通道相比，使用经 1% Teflon AF 2400 修饰的微通道培养 hCMEC/D3，我们没有观察到任何形态差异。此外，从表面改性微通道测试的 CBD 灵敏度比未改性微通道高出很多（8 倍）。

尽管本文的重点是证明用Teflon AF 2400 修饰的 PDMS 表面能显著降低 CBD 的吸收，但要成功地将这项技术应用到更广泛的 OOC 领域，还需要解决一些重要因素。首先，我们需要确保特氟龙涂层能在细胞培养实验期间保持化学和机械稳定性。对于典型的 OOC 系统，细胞培养的持续时间从数周到数月不等。其次，应在特氟龙改性表面上测试不同类型的细胞及其反应。在本文中，我们只对 hCMEC/D3 细胞系及其通透性进行了形态学评估，其他基本细胞功能仍需验证。最后，还应仔细研究各种不同类型的药物化合物，例如具有不同疏水性和大小的化合物。我们相信，这些验证步骤对于确保我们所报告的简单的一步表面改性方法能够被完全采用以及扩大各种 OOC 系统在药物发现应用中的影响至关重要。

富临塑胶供应Teflon AF 2400管材、薄膜、粉末、溶液，请立即联系我们讨论您的详细需求。

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肝脏在代谢、内源性和外源性底物的生物转化以及外源性微生物的解毒中发挥着核心作用。解剖学上，肝脏内主要有四种类型的细胞：肝窦内皮细胞（LSEC)、库普弗细胞（KC)、肝星状细胞（HSC）和肝实质细胞（HC)。2015年，来自德国Jena University Hospital的研究人员报道了一种嵌入微流体支持的生物芯片中的三维肝脏类器官的建立。研究人员使用新鲜分离的人脐静脉内皮细胞代替肝窦内皮细胞，利用单核细胞来源的巨噬细胞模拟库普弗细胞的功能，永生化的人类星状细胞系LX-2作为主要的星状细胞替代物。在生物芯片的培养过程中，HepaRG细胞持续分化为表现出干细胞表型的细胞和具有胆管上皮细胞的表型，这些细胞自组织成肝细胞层，在肝细胞样细胞间具有功能性胆管。相关研究成果以《A microfluidically perfused three dimensional human liver model》为题发表在Biomaterials杂志上。
如图所示，研究者在芯片上模拟了人体肝窦结构，在膜两侧分别模拟血管和肝细胞层并种植对应细胞，膜用作两个细胞层的基质，将它们彼此分离的同时模仿Disse空间(SD)。



多层肝类器官中人肝窦的体内形态的适应

在血管细胞层，HUVEC与巨噬细胞共培养。在肝细胞层，由分化的HepaRG肝细胞样细胞和LX-2星状细胞共培养。在共培养的条件下，细胞色素P450酶的表达情况有所改善。



在微流控生物芯片中建立三维肝脏模型

培养基的氧饱和度作为调节肝细胞代谢能力的关键参数，为了对细胞培养过程中氧水平进行非接触式实时测量，研究者将基于发光的传感器点集成到生物芯片的入口和出口处。



通过荧光发射传感器点测量细胞培养基中的氧饱和度

此外，研究者通过测量HepaRG细胞的细胞内ATP和ADP含量，解决了含氧量正常和缺氧条件下培养基灌注对细胞能量水平的影响。在肝脏类器官的静态和灌注培养物中，发现ATP水平在缺氧条件下显著降低。




在静态和动态培养条件下，在 MOTiF 生物芯片内膜的相对侧与 HUVEC 细胞层共培养 4 天的 HepaRG 细胞层的细胞 ADP 和 ATP 含量

肝细胞的适当极化是功能活跃的肝胆小管形成的先决条件，代表了HepaRG细胞系的一个重要特征。因此研究者对各种肝分化和极化标记蛋白的表达和定位进行了染色，如ASGPR-1、ZO-1、MRP-2、CDF等。



在肝脏类器官的逐步组装过程中，HepaRG细胞层中特定标记物的免疫染色

随后，研究者观察了在静态和灌注培养下动态灌注对肝脏类器官血管层中EC极化的改善，并且比较了动态和静态培养条件下相关蛋白表达水平的变化。


MRP-2位于肝细胞的微绒毛上，当通过扫描电子显微镜将灌注的肝脏类器官与静态组织培养物进行比较时，灌注培养下的HepaRG细胞表现出更高的可塑性和更高的微绒毛密度。接下来，研究者讨论了血管灌注过程中整个肝脏类器官的细胞耗氧量。与观察到氧饱和度快速下降的静态培养相反，50 ml/min的血管灌注足以为肝脏类器官的血管细胞层提供稳定的氧气供应。



静态和动态培养条件下肝脏类器官微观结构和耗氧量的比较

本研究建立了包含所有主要肝细胞类型的功能性肝脏类器官，肝脏模型显示出明显的分化和结构重组，与体外原代人肝组织非常相似。这种肝脏模型为在细胞水平上研究肝脏生理学、新陈代谢和潜在分子过程提供了宝贵工具，为毒理学和药理学筛选奠定了基础，另外，此模型也非常适合研究特定基因和蛋白质在肝功能中的作用。

参考文献：
Rennert K, Steinborn S, Gröger M, Ungerböck B, Jank AM, Ehgartner J, Nietzsche S, Dinger J, Kiehntopf M, Funke H, Peters FT, Lupp A, Gärtner C, Mayr T, Bauer M, Huber O, Mosig AS. A microfluidically perfused three dimensional human liver model. Biomaterials. 2015 Dec;71:119-131. doi: 10.1016/j.biomaterials.2015.08.043. Epub 2015 Aug 25. PMID: 26322723.

队长是我

肝脏负责代谢大多数药物，因此是受药物不良反应影响的主要组织之一。药物性肝损伤（DILI,drug induced liver injury）是几乎所有种类药物的潜在并发症。不幸的是，DILI在临床前药物开发过程中未被发现，或在临床首次被发现后暂停试验，等待进一步研究调查的情况并不罕见。在许多情况下，没有什么可担心的，因为通常停止用药会停止DILI反应。然而，有点令人不安的是，已知至少有750种FDA批准的药物具有一定程度的DILI风险[Thakkar et al., 2017]，而且太多潜在的新药由于过度的DILI风险而未获得批准。
为了降低药物的自然损耗率，需要在临床前研发管线中尽早确定潜在的人体DILI反应。这样可对有希望的药物的毒性问题通过“设计排除”。为了有效地降低这一过程的风险，必须应对一些挑战，包括：

• 动物DILI研究及其与人类的有限相关性
  
  
  
  • 动物模型曾错误地将有毒药物识别为安全药物，并将有用药物标记为有毒药物(Van Norman, 2019).
    
  • 对于新的人类特异性药物形式，动物生理学不适用
    
  
  
• 需要改进标准体外试验模型的复杂性，使其以更准确地代表人体的方式表现和响应药物
  
• 历史上，使用传统方法筛选由预先存在的肝病或遗传易感性引起的特异性反应一直具有挑战性。
  

动物模型的不一致性，再加上2D肝脏培养的有限简单性，导致迫切需要更具预测性的临床前体外工具来研究DILI。最近的焦点集中在3D细胞培养平台上。这种方法产生了复杂和功能性的人体体外肝脏模型，有可能克服这些挑战，并在将药物从开发到上市时指导更明智的决策 [Weaver et al, 2020]。



Fig 1: DILI是一种多因素的发病机制

体外DILI测试工作流程

每一种潜在药物在早期发现时都会经过一系列测试，从简单的高通量批量筛选细胞活力开始，这就提出了一个问题：该药物是否会杀死2D中生长的肝细胞？随着临床前阶段的发展，需要测试的药物和浓度要少得多，这种减少便于使用较低通量、更复杂的3D组织模型。通过采用这些方法，研究人员可以在进入临床之前更准确地预测体内DILI的风险。
肝脏是一个3D组织，因此，3D肝细胞模型，如细胞球体，与2D相比显示出更好的结果。在这里，细胞形成生理相关的细胞相互作用，最终产生更多类似体内的形态、代谢活性和延长培养的时间。就DILI的检测而言，2D批次筛选通常会检测到约三分之一对肝脏有不良影响的药物，然而，InSphero和阿斯利康之间的一项合作研究，使用3D原代人肝细胞和非实质细胞球体，通过鉴定出高达60%的DILI阳性化合物，改进了这一点(Procter et al., 2017)。但40%的药物仍未被检测到，因此，除了3D技术外，还有什么样的进步可以帮助识别所有具有DILI风险的药物？
虽然一些球体方法可产生肝细胞极化，但这些模型通常无法达到肝脏中的组织水平结构。此外，肝细胞具有异常的代谢能力，需要充足的氧气输送，这对球体培养物提出了挑战，因为球体培养物在营养扩散方面受到了众所周知的限制。在不重塑肝脏的高度有序组装的情况下，具有微妙或非常特殊作用的毒性药物可能会在不知情的情况下通过测试。与此同时，细胞培养模型之外的变量也会影响DILI。其他器官和组织可以调节肝细胞如何代谢药物。例如，肠道吸收药物的动力学可以影响肝脏中代谢物驱动的毒性。同样，疾病病理生理学（例如非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD））也可以改变肝脏对药物的反应，可能会加剧小剂量的损伤。能够将这些复合因素纳入临床前工具包将大大有助于确保只有肝损伤风险较低的药物进入临床试验。
通过“液流”获取更多相关信息

上述限制可以通过将灌注结合到3D培养中来解决。通过在连续灌注的3D支架上生长与生理学相关的原代肝细胞组合（包括那些具有基因变异的患者，这些变异会使患者患病），可以尽可能复制肝组织的微结构。随着流体持续循环以提供机械刺激、持续的氧输送和极化，这些微环境中的肝细胞可以维持高度功能化长达4周。



Fig 2: 肝脏芯片模型重建了肝脏微体系结构，并可以概括代谢性疾病（如NASH）的表型

除了扩展体外慢性给药研究的领域外，这些灌注器官芯片模型（OOC，Organ-On-Chip）通过将循环免疫细胞纳入系统，提供了更大的灵活性，以揭示免疫相关的毒性问题。还可能诱导常见的肝脏疾病模型（如NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎（NASH））以解密潜在的发病敏感性。
为了说明化合物毒性的多器官效应，液流使单个OOC能够连接在一起，形成多器官系统。这些系统可以模拟基本过程，如药物吸收和代谢，并能够理解器官之间的相互作用，如代谢物驱动的毒性、多器官毒性或炎症，这些在使用常规实验方法检测时可能不那么明显。虽然其通量可能较低，但OOC使研究人员能够超越简单地识别急性/慢性肝毒性的存在，或将体外结果转化为临床环境；它们使我们能够调查其中的原因。
使用多个实验终点回答更多问题

虽然在药物发现过程中，较简单的系统比以往任何时候都能成功地标记肝毒性信号的存在或不存在，但通过使用更复杂的灌注OOC系统来提供详细数据信息，这些系统得到了完美的补充。实现数据丰富性和高检测灵敏度需要一定量的体量。需要50万个由大量培养基（范围在1-2 mL之间）灌注的原代细胞产生足够的马力以复制第1和第2阶段代谢（特别重要，因为标准动物和体外模型被证明对DILI预测不佳的因素之一，是因为它们的非人代谢谱），并增加测定灵敏度，从而可以检测肝功能的复杂临床化学指标，例如ALT/AST。
但这是值得投资的，因为科学家现在可以利用更简单的2D或3D系统，甚至是使用“芯片”技术在微尺度上操作的灌注微生理系统（MPS，microphysiological system），在体外发现以前不可能的独特认知。纵向研究中随时间采集的样本提供了生物化学评估机会，随着时间的推移形成了一幅实验数据图谱。实验结束时回收的相对大量的组织可以在其他蛋白质组学或基因组学研究中进行分析，以查看基因的上调和下调，从而提供更完整的毒理学概况。
这种多重化的能力使研究人员能够超越简单地识别急性或慢性肝毒性的存在，或者将使用实验室培养的器官在体外获得的结果转化为临床环境，但它使我们能够研究原因背后的机制(Novac et al., 2021)。
了解原因有助于解决问题

了解任何特定毒性问题背后的机制是非常宝贵的。这些信息使团队有机会重新设计，有可能将项目从失败中拯救出来。通过机理指纹图谱或毒性曲线来指导重新设计，这一迭代过程大大提高了效率。
同样，生物学认知可以帮助研究人员确定哪些数据最相关。临床前动物试验中不时出现与人体试验或其他体内动物物种相矛盾的肝脏毒理学信号。在第一次人体内研究之前生成可比性的人体数据提供了一定的信心，以确保信号可能是受试动物物种的功能，而不是化合物本身引起的。这种认知可以防止项目不必要地终止。谁知道有多少潜在的重量级药物被阻止发挥其潜力？加州大学圣地亚哥分校（UCSD）以一个简短的客户网络研讨会强调了这一点。
获得超越小分子的毒理学见解

传统的毒理学工作往往侧重于小分子化合物，然而，新的人类特异性药物形式（如生物制剂、脂质纳米粒包裹的产品或基于寡核苷酸/RNA的治疗）已成为发现和开发的前沿。虽然这些新产品不太容易发生DILI，但仍有可能诱发肝损伤。Astellas Audentes的肌管性肌病基因治疗试验就是一个可怕的例子。虽然该疗法取得了令人鼓舞的结果，但4名肝衰竭患者的死亡无疑使其未来受到质疑。在这种情况下，OOC特别有利于测试安全性，因为它消除了导致动物模型不适用的遗传、代谢和/或免疫反应的障碍，同时也解决了体外平台缺乏生理液流和结构的问题。事实上，OOC对药物类型“不可知”，并确保组织相关部位的相关受体吸收相关分子。



Fig 3: 器官芯片模拟器官表型，使科学家能够重现与人体相关的药物剂量和相关毒性

方法范围

OOC提供了以前不可能的深刻毒理学认知。关于OOC有效性的既定共识，加上强烈的监管兴趣（keen regulatory interest）和减少动物使用的政治压力（political pressure to reduce animal usage ），正在推动对这一技术的采用。在药物发现过程中嵌入OOC技术，以尽早发现安全毒理学问题无疑将降低风险并提高效率。制药和生物技术公司正在追逐OOC技术；大型公司可能会发现，在内部建立实验流程是最佳途径，而对于小型或虚拟生物技术公司而言，专家的全方位实验服务可能提供更实用的方法。同样重要的是要注意，虽然不同的OOC系统在某些方面是相似的，但在其他方面却可能截然不同。因此，为项目选择正确的OOC系统是很重要的。如上所述，对于DILI研究而言，选择一种系统至关重要：
1）易于操作
2）产生大量用于取样的生物材料
3）结合生理相关液流系统
在CN Bio，我们提供一系列OOC选项，从内部采用设备自行研究（PhysioMimix OOC 系列微生理系统）到完整的药物代谢和安全性毒性测试服务（Drug Metabolism and Safety Toxicity Testing Service）。后一种选项有助于为希望外包的人更详细地确定药物诱导肝毒性的机制方面。我们的系统采用大多数细胞培养科学家所熟悉的开放式微孔板，能够产生大量样本（细胞数量和培养基），同时保持连续液流以产生生理相关结果。
联系我们索取点播研讨会（on-demand webinar） ，讨论如何使用人体肝脏芯片（也称为肝脏微生理系统）来了解药物诱导肝损伤（DILI）的因果关系和机制。MPS使用一组广泛的轻度至重度肝毒性化合物，预测了以前未在体外实验中鉴定得出的药物毒性。


观看视频，直观了解CN Bio的PysioMimix器官芯片工作原理


https://www.zhihu.com/video/1566751047217041411

卡卡

全球器官芯片（OOC）研发热情高 未来应用前景广阔

　　器官芯片（OOC）是一种通过微芯片制造方法制造的微流体细胞培养设备。器官芯片是多研究领域融合结果，涉及到干细胞技术、微流控技术、微电子技术、组织工程、检测技术等。器官芯片在新药研发、生物医学、药物筛选、个性化医疗等领域具有广阔前景，因此备受国内外研究者青睐。







　　新药研发具有高投入、高风险、周期长、失败率高等特征，同时基于细胞和动物模型临床前研究具有一定局限性，随着新药研发需求释放，如果提高研发效率、降低研发成本，成为药企迫切需要解决的问题。器官芯片是一种潜力新药研发手段，有助于提高临床前研发效率及准确性，未来应用前景广阔。

　　根据新思界产业研究中心发布的《2022-2026中国器官芯片行业市场现状综合研究及投资前景预测报告》显示，受技术限制，目前全球器官芯片市场仍处于起步阶段，但基于其独特性能及技术优势，器官芯片市场增长迅速，2021年，全球器官芯片市场规模约0.5亿美元，预计2022-2027年，全球器官芯片市场将保持36.5%以上的年均复合增长率增长。

　　全球范围内，器官芯片市场主要分布在北美、欧洲等地区，其中北美拥有先进技术及丰富经验，是全球最大市场，2021年市场占比达到四成以上。亚太地区器官芯片市场规模较小，但随着亚太地区经济、医疗快速发展，亚太地区器官芯片市场发展潜力较大，在该区域内，中国、日本等国家将是重要参与者。

　　器官芯片技术壁垒高，但受广阔市场前景吸引，布局这一市场的企业数量在不断增加，其中领先企业有Emulate、Mimetas、TissUse、CN  Bio  Innovations、Nortis、Kirkstall等。除制药领域外，化妆品、消费品领域企业也十分关注器官芯片市场，如欧莱雅、阿斯利康、罗氏等企业均已与器官芯片机构展开合作。

　　从国内市场来看，早期我国医药研究以仿制药为主，器官芯片需求较低，但近年来，在政策引导下，创新药、生物医药得到快速发展，器官芯片研发热情随之提升。目前我国器官芯片市场仍处于商业化早期阶段，行业内企业有北京大橡科技、溥思生物、艾玮得生物等，其中北京大橡科技是行业领先企业。

　　新思界行业分析人士表示，作为新型药物研发技术，器官芯片有助于降低药物研发成本、提高研发效率及准确度，在创新药、生物医药快速发展背景下，器官芯片应用前景广阔。器官芯片技术门槛高，目前全球器官芯片市场仍处于起步阶段，且主要分布在欧美地区，但随着国内技术突破、需求释放，我国器官芯片市场也将迎来发展机遇。