请问CRISPR/Cas9的整体原理是什么？

笑看风云

就是 如何把cas9蛋白指引到预订位置的原理那种
原文地址：https://www.zhihu.com/question/265204609

长长的路

在并发编程中我们都知道i++操作是非线程安全的，这是因为 i++操作不是原子操作。
如何保证原子性呢？常用的方法就是加锁。在Java语言中可以使用 Synchronized和CAS实现加锁效果。
Synchronized是悲观锁，线程开始执行第一步就是获取锁，一旦获得锁，其他的线程进入后就会阻塞等待锁。如果不好理解，举个生活中的例子：一个人进入厕所后首先把门锁上（获取锁），然后开始上厕所，这个时候有其他人来了只能在外面等（阻塞），就算再急也没用。上完厕所完事后把门打开（解锁），其他人就可以进入了。


CAS是乐观锁，线程执行的时候不会加锁，假设没有冲突去完成某项操作，如果因为冲突失败了就重试，最后直到成功为止。
1. 什么是 CAS？

CAS（Compare-And-Swap）是比较并交换的意思，它是一条 CPU 并发原语，用于判断内存中某个值是否为预期值，如果是则更改为新的值，这个过程是原子的。下面用一个小示例解释一下。
CAS机制当中使用了3个基本操作数：内存地址V，旧的预期值A，计算后要修改后的新值B。
（1）初始状态：在内存地址V中存储着变量值为 1。


（2）线程1想要把内存地址为 V 的变量值增加1。这个时候对线程1来说，旧的预期值A=1，要修改的新值B=2。


（3）在线程1要提交更新之前，线程2捷足先登了，已经把内存地址V中的变量值率先更新成了2。


（4）线程1开始提交更新，首先将预期值A和内存地址V的实际值比较（Compare），发现A不等于V的实际值，提交失败。


（5）线程1重新获取内存地址 V 的当前值，并重新计算想要修改的新值。此时对线程1来说，A=2，B=3。这个重新尝试的过程被称为自旋。如果多次失败会有多次自旋。


（6）线程 1 再次提交更新，这一次没有其他线程改变地址 V 的值。线程1进行Compare，发现预期值 A 和内存地址 V的实际值是相等的，进行 Swap 操作，将内存地址 V 的实际值修改为 B。


总结：更新一个变量的时候，只有当变量的预期值 A 和内存地址 V 中的实际值相同时，才会将内存地址 V 对应的值修改为 B，这整个操作就是CAS。
2. CAS 基本原理

CAS 主要包括两个操作：Compare和Swap，有人可能要问了：两个操作能保证是原子性吗？可以的。
CAS 是一种系统原语，原语属于操作系统用语，原语由若干指令组成，用于完成某个功能的一个过程，并且原语的执行必须是连续的，在执行过程中不允许被中断，也就是说 CAS 是一条 CPU 的原子指令，由操作系统硬件来保证。

在 Intel 的 CPU 中，使用 cmpxchg 指令。

回到 Java 语言，JDK 是在 1.5 版本后才引入 CAS 操作，在sun.misc.Unsafe这个类中定义了 CAS 相关的方法。
public final native boolean compareAndSwapObject(Object o, long offset, Object expected, Object x);
​
public final native boolean compareAndSwapInt(Object o, long offset, int expected, int x);
​
public final native boolean compareAndSwapLong(Object o, long offset, long expected, long x);可以看到方法被声明为native，如果对 C++ 比较熟悉可以自行下载 OpenJDK 的源码查看 unsafe.cpp，这里不再展开分析。
3. CAS 在 Java 语言中的应用

在 Java 编程中我们通常不会直接使用到 CAS，都是通过 JDK 封装好的并发工具类来间接使用的，这些并发工具类都在java.util.concurrent包中。

J.U.C 是java.util.concurrent的简称，也就是大家常说的 Java 并发编程工具包，面试常考，非常非常重要。

目前 CAS 在 JDK 中主要应用在 J.U.C 包下的 Atomic 相关类中。


比如说 AtomicInteger 类就可以解决 i++ 非原子性问题，通过查看源码可以发现主要是靠 volatile 关键字和 CAS 操作来实现，具体原理和源码分析后面的文章会展开分析。
4. CAS 的问题

CAS 不是万能的，也有很多问题。
敲黑板：CAS有哪些问题，这是面试高频考点，需要重点掌握。
4.1. 典型 ABA 问题

ABA 是 CAS 操作的一个经典问题，假设有一个变量初始值为 A，修改为 B，然后又修改为 A，这个变量实际被修改过了，但是 CAS 操作可能无法感知到。
如果是整形还好，不会影响最终结果，但如果是对象的引用类型包含了多个变量，引用没有变实际上包含的变量已经被修改，这就会造成大问题。
如何解决？思路其实很简单，在变量前加版本号，每次变量更新了就把版本号加一，结果如下：


最终结果都是 A 但是版本号改变了。
从 JDK 1.5 开始提供了AtomicStampedReference类，这个类的 compareAndSe方法首先检查当前引用是否等于预期引用，并且当前标志是否等于预期标志，如果全部相等，则以原子方式将该引用和该标志的值设置为给定的更新值。
4.2. 自旋开销问题

CAS 出现冲突后就会开始自旋操作，如果资源竞争非常激烈，自旋长时间不能成功就会给 CPU 带来非常大的开销。
解决方案：可以考虑限制自旋的次数，避免过度消耗 CPU；另外还可以考虑延迟执行。
4.3. 只能保证单个变量的原子性

当对一个共享变量执行操作时，可以使用 CAS 来保证原子性，但是如果要对多个共享变量进行操作时，CAS 是无法保证原子性的，比如需要将 i 和 j 同时加 1：
i++；j++；
这个时候可以使用 synchronized 进行加锁，有没有其他办法呢？有，将多个变量操作合成一个变量操作。从 JDK1.5 开始提供了AtomicReference 类来保证引用对象之间的原子性，你可以把多个变量放在一个对象里来进行CAS操作。
5. 有态度的总结

CAS 是 Compare And Swap，是一条 CPU 原语，由操作系统保证原子性。
Java语言从 JDK1.5 版本开始引入 CAS ， 并且是 Java 并发编程J.U.C 包的基石，应用非常广泛。
当然 CAS 也不是万能的，也有很多问题：典型 ABA 问题、自旋开销问题、只能保证单个变量的原子性。

长长的路

一．CRISPR检测-认识CRISPR/Cas系统

CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），即很多条相同的小段，然后把它们均匀地插入了一段杂乱排列的DNA一样。这些序列称为重复序列(repeat)，而把它们隔开的杂乱排列的DNA称为间隔序列(spacer)。而Cas的全称是CRISPR associated（CRISPR关联），简称为CRISPR/Cas系统。
CRISPR/Cas系统来源于细菌的免疫系统，在原核生物中，CRISPR-Cas系统作为免疫系统，利用CRISPR RNAs（crRNAs）作为引导分子，靶向识别入侵核酸，在抵御外来病毒入侵。



图1.CRISPR/Cas系统

二、CRISPR/Cas系统具体是如何来抵御外来病毒入侵的呢？
其过程主要有以下三个阶段：
1、适应阶段：将外来的病毒或噬菌体的 DNA 片段作为间隔序列（spacer）整合到 CRISPR array ；
2、表达阶段： CRISPR array 被转录为初级转录产物 pre-crRNA，pre-crRNA 被 Cas 蛋白加工产生成熟的 CRISPR RNA（crRNA）；
3、干扰阶段：成熟的 crRNA 与 Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合体，crRNA 引导 Cas 蛋白特异性靶向切割入侵者的核酸，达到免疫防御的目的。



图2. CRISPR-Cas 免疫涉及三个不同的机制阶段

知道了CRISPR/Cas的来源及在细菌免疫系统中发挥的作用，人们开始将此免疫系统应用在基因编辑上，那么我们再一起看一下CRISPR/Cas系统是如何应用到CRISPR检测的呢？
三．CRISPR检测原理
CRISPR检测技术所用的Cas蛋白主要有Cas12、Cas13和Cas14，与Cas9不同的是，Cas12、Cas13和Cas14除了具有特异性切割靶序列的功能外，在切割靶标序列之后，还具有非特异性切割其它核酸序列的功能（即Cas蛋白的反式切割活性）。在反式切割激活的状态下，可非特异性切割任意单链，将体系中的荧光标记探针切碎，即可用来检测信号。由此开展各种基因检测技术。
以Cas12a为例：Cas蛋白反式切割活性激活过程
Cas12a处理其自身的crRNA5’端，dsDNA靶标识别始于WED和PI结构域的PAM识别，从而促进dsDNA靶标的展开。r-环的形成是由TS结合crRNA片段而启动的。过程的crRNA-TS配对，同时TS-NTS展开导致形成完整的r-环。crRNA-TS DNA氢化诱导REC叶的构象变化，导致RuvC结构域的催化位点的变构解封。NTS结合槽引导移位的NTS向RuvC催化位点移动，导致NTS的顺式裂解。随后，进一步解开pam-远端TS-NTS双链，使TS进入RuvC催化位点，导致TS的顺式裂解。pam-远端dsDNA被释放，而PAM-近端dsDNA仍然与Cas12a-crRNA复合物结合。这使得Cas12a保持在一个催化激活的构象中，这允许非靶标ssDNA的反式裂解。主要概括为以下四个步骤：
1、Cas12a蛋白的WED和PI结构域识别dsDNA靶标的PAM序列，从而促进dsDNA靶标的展开。
2、crRNA和靶标链互补配对，和非靶标链行成R-loop环。
3、REC远离RuvC，RuvC结构域切割位点暴露，顺式切割非靶标链和靶标链。
4、PAM远端dsDNA被释放，Cas12a-crRNA复合物与近端dsDNA结合，Cas12a反式裂解被激活。



图3. Cas12a介导的DNA顺式和反式裂解模型图

一句话概括来说CRISPR检测就是由靶标核酸激活Cas蛋白的反式切割活性，将体系中的荧光标记探针切碎，发出荧光信号，完成靶标核酸检测的过程。


我们是专注于做CRISPR检测的团队，自主研发的Cas12a蛋白，Cas12b蛋白，Cas13a蛋白活性远高于市面上其它公司，如果你也在正好在做CRISPR检测，欢迎咨询：18102225074（微信同号）。

大力水手

CRISPR/Cas9系统广泛应用于多种细胞基因突变细胞株的构建：其中包括了细胞基因单点突变和多带你突变，还有例如动物细胞定点突变的流程比较服务，如何快速高效构建自己的基因突变细胞株是很多人关心的问题。但是，实验时我们往往发现，很难获得细胞点突变的纯合克隆或者杂合克隆，预期的定点突变经常伴随着等位基因的非特异性随机插入、缺失或其他突变，导致克隆的阳性率往往徘徊在1%以下。

技术流程图



CAS-9基因编辑技术


    点突变成功率低下是由于细胞的DNA损伤修复机制导致的，在哺乳动物中Cas9-sgRNA与基因组目标序列形成三元复合物之后，Cas9的两个DNA酶结构域可以切割 DNA的磷酸酯键，最终形成双链断裂损伤 (DSBs)，DSBs会激发细胞本身的两种 DNA损伤修复机制，同源重组修复 (HDR) 机制和非同源重组末端直接连接(NHEJ)修复机制。一般而言，基于同源序列的精确敲入的效率远远低于NHEJ诱导的靶向插入。因此，基因定点突变虽然为各种科研工作所需要，但这项技术始终具有很高的技术门槛，成为开展基因功能与机制深入与精细研究的拦路虎。
HDR修复主要是在内源或者外源同源供体DNA存在的情况下对DSB进行修复，使用人工设计的外源的单链（例如ssODN）或者双链供体 DNA可以对目标靶序列进行DNA序列的敲入和辅助大片段敲除，或者构建点突变。NHEJ修复途径不依赖同源重组方式，而是在相关蛋白的介导下双链断裂直接连接修复，但是在修复过程中会产生插入缺失突变。
提高点突变实验成功率：
（1）引入同义突变，防止Cas9-sgRNA的二次切割
（2）优化切割位点到突变位点的距离
（3）通过优化距离提高纯合或者杂合的偏向性。
中国细胞库-hek293-肿瘤细胞购买-苏州阿尔法生物实验器材有限公司1、引入同义突变，防止Cas9-sgRNA的二次切割
点突变一般采用单链寡核苷酸（ssODN）作为HDR模板，可以通过在PAM位点或者guide区域靠近PAM位点引入突变的方式，显著降低二次切割的概率。
如果点突变位点距离PAM位点较远（＞10bp），通常可以在PAM位点附近引入同义突变，防止二次切割。如果PAM位点或者guide区域不在编码区域上，无法引入同义突变，则可以通过两步法进行实验：第一步，先引入点突变和PAM位点突变，获得双突变的阳性克隆；第二步，将PAM位点突变回野生型，获得仅靶位点突变的阳性克隆。



基因敲除细胞株

2、优化切割位点到突变位点的距离
HDR修复并不需要完整的同源臂作为修复模板，细胞可以仅使用同源臂的一部分用于HDR修复，这使得远离Cas9-sgRNA切割位点的突变，无法被有效整合进基因组。
研究发现，突变整合效率随着与切割位点距离的增加而迅速下降。与切割位点距离10bp整合效率下降约一半，超过30bp则一般无法整合到基因组。
因为，我们通常建议突变位点与切割位点的距离不超过10bp，从而保证较高的整合效率。（这个也是Cas9X | 海星生物为什么建议细胞的点突变附近要有合适的gRNA序列）




细胞基因敲除

crispr-cas9基因编辑技术-基因编辑公司-crispr基因编辑技术-细胞基因敲除3、通过优化距离提高纯合或者杂合的偏向性
有一些课题研究，如阿尔茨海默氏病的研究，是需要用到杂合突变的。而通过优化突变位点与切割位点的距离，可以帮助我们更有效地获得杂合或者纯合的突变克隆。
如果想获得纯合克隆，与切割位点距离建议不超过10bp；如果想获得杂合克隆，与切割位点距离则建议为5-20bp。
  Cas9-Cell line Gene Mutation service（CGM）基因点突变细胞系是细胞基因研究方法中非常有用的一个手段，可以在细胞内原位对点突变的功能进行研究。在细胞系上实现高效的转染是实现基因点突变的前提；提高效率要解决问题是：Cas9切割位点与“点突变”位点之间距离导致点“点突变”效率大幅下降的问题，还有“点突变”载体的选择问题。
  Cas9X针对不同单碱基突变的情况使用不同的Mutation载体策略：包括短同源臂可以使用Oligo引入突变，需要长同源臂的使用ssDNA引入突变。而针对难以操作的细胞系，将需要通过先构建Cas9稳转细胞株再进行gRNA和载体共转染来提高效率。Cas9X针对每个具体的位点、每个具体的细胞优化实验条件用来满足不同细胞系和不同位点突变的服务需求。

队长是我

CRISPR（Clustered,  Regularly Interspaced, Short Palindromic Repeats）– Cas 系统在微  生物中进化，作为防御入侵噬菌体的防御机制。这个系统是一套基因编辑工具的基础，这些工具能够在从健康和诊断到农业和能源的广泛研究领域取得进展。更多内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn
基因编辑是对DNA序列的一种特定的、有针对性的改编，涉及到DNA的添加、去除或修饰。CRISPR 系统通过两个主要组件完成基因编辑：
1、向导RNA（gRNA）
2、细菌来源的核酸酶（如 Cas9）
gRNA是一个特定的RNA序列，旨在识别核酸酶并将其导向目标脱氧核糖核酸区域，它由两部分组成：CRISPRRNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。crRNA是与靶DNA互补的  17-20个核苷酸序列，因此根据靶基因而变化。相反，tracrRNA是一个不变的序列，作为将Cas核酸酶连接到crRNA的支架。
第一个CRISPR编辑系统使用了一个由两部分组成的gRNA复合物，由一个单独的crRNA和tracrRNA组成，但现在标准的做法是使用一个单一的gRNA（sgRNA）方法，将crRNA和tracrRNA结合成一个RNA分子。图1显示了CRISPR基因编辑复合体的总体示意图




CRISPR复合物的靶向性
根据设计，crRNA与靶DNA互补，并允许gRNA将CRISPR复合体引导到正确的基因组位置，以进行基因编辑。为了使CRISPR复合物与DNA成功结合，靶位点下游必须存在一个原间隔基邻近基序（PAM）。
切割DNA
一旦CRISPR复合物到达并结合目标位置，核酸酶就可以切割DNA。CRISPR复合物包含两个独立的核酸酶结构域，每个结构域切割一条特定的DNA链。HNH核酸酶结构域切割与gRNA互补的链，而RuvC核酸酶结构域负责切割非互补链。两个核酸酶结构域协同工作，产生双链断裂（DSB），发生在PAM上游三个核苷酸处。

DSB的修复
一旦核酸酶切割DNA，天然的细胞DNA修复机制会试图通过以下两种机制之一来修复DSB：

• 非同源末端连接（NHEJ）。
  
• 同源导向修复（HDR）。
  

通过NHEJ进行基因敲除
NHEJ倾向于主要的细胞DSB修复机制。当DNA末端在缺乏同源DNA模板的情况下重新连接时，它会在DNA中引入插入或缺失错误（indel）导致移码突变和过早终止密码子的Indels可以产生功能缺失（LOF）突变，这是CRISPR用于破坏（敲除）基因的主要手段。

经由HDR的基因敲入
CRISPR可以利用HDR进行特定基因序列的替换和表达（敲入）。除了CRISPR的主要成分之外，HDR介导的CRISPR编辑还需要一个含有新的所需序列的DNA供体模板，其两侧是同源区域。这种供体模板的引入，连同CRISPR成分，允许细胞通过同源重组修复DSB。结果可使新序列被整合到目标基因中。

清风寡欲

自我感觉俺的回答挺清晰、详细的，欢迎指正

CRISPR-Cas系统，即规律性成簇间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）及相关蛋白（CRISPR-associated, Cas）系统。

与锌指核酸酶（zinc-finger nuclease, ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）同属于人工核酸内切酶（engineered endonuclease, EEN）技术，用于基因组的定点编辑。
EEN的结构总地包括「DNA结合结构域」和「DNA切割结构域」两部分。分别用于「特异性识别DNA」和「切割DNA以形成DNA双链断裂 (double-strand break, DSB)」。
DSB可以激活DNA损伤修复——非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR），利用这个过程产生的基因突变进行遗传改造。

ZFN和TALEN的DNA结合结构域构建需要执行蛋白融合过程，技术难度大，而CRISPR-Cas技术的优势是，利用设计的特异性向导RNA分子（sequence-specific guide RNA）作为DNA结合结构域替代了蛋白融合过程。
<hr/>CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古生菌的染色体上，与其免疫有关，用以防御外来遗传物质，获得抗噬菌体的能力。



CRISPR-Cas系统的自我与非我的识别机制

系统由CRISPR序列与Cas基因家族组成：CRISPR是高度保守的重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）的间隔排列；Cas基因家族即高度保守的CRISPR相关基因（CRISPR-associated gene, Cas gene），可编码DNA切割结构域。其中，CRISPR重复序列中包含的回文结构可形成保守的RNA二级结构，将与Cas蛋白结合发挥作用。
CRISPR系统分为两个子系统：

• 子系统一产生泛表达的核心蛋白Cas1、Cas2，用于获取新的间隔序列；
  
• 子系统二分为Type Ⅰ、Type Ⅱ和Type Ⅲ三种类型，分别产生标志性蛋白Cas3、Cas9和Cas10，用于加工crRNA、识别降解外源遗传物质。
  

CRISPR-Cas系统功能的行使分为「获取」、「表达」和「干扰」3个阶段。




CRISPR-Cas系统的工作机制

一、在泛表达的Cas1、Cas2蛋白的参与下，获取新的间隔序列

• 扫描入侵核酸潜在的PAM以确定原间隔序列（PAM, protospacer adjacent motifs, 原间隔序列临近基序，是紧邻原间隔序列5'端或3'端的保守序列）
  
• 切割新的间隔序列后，在其5'端合成重复序列
  
• 将重复序列-间隔序列插入靠近CRISPR导向序列的重复区间内
  

二、表达CRISPR基因座
CRISPR基因座在外源遗传物质的诱导下，转录crRNA并加工成熟
三、干扰外源遗传物质
crRNA与特异性Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，复合物与靶标位点配对后摧毁外源遗传物质。在这个过程中，保守的PAM起着分清敌我的作用：即使原间隔序列能与crRNA完美配对，PAM的突变同样会使CRISPR-Cas系统失效。

并且，由于Cas蛋白的多样性，此系统既能干扰DNA，又能干扰RNA。

<hr/>利用CRISPR-Cas系统中的Type Ⅱ，通过改造使其成为基因编辑的有力工具。

Type Ⅱ具有以下特点：

• CRISPR-Cas基因座上游会表达tracrRNA（trans-activating crRNA）
  
• tracrRNA与RNase Ⅲ一起参与crRNA的加工
  
• tracrRNA将与crRNA部分配对，指导Cas9切割DNA双链。
  

通过创造性地连接tracrRNA-crRNA为嵌合RNA——sgRNA（single guide RNA），简化的操作过程：sgRNA的在PAM的参与、Cas9的介导下与双链DNA配对，Cas9的2个活性中心切割靶标DNA为DSB，引起NHEJ机制，产生突变。sgRNA的tracrRNA段越长，Cas9的切割效果越好。



Cas9的结构与crRNA改造

虽CRISPR-Cas9可能出现脱靶现象，经过改进后，比ZFN和TALEN相比优势明显。

图源佚名，欢迎补充