标准品的构建与相关知识点

青草

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来源：






举例：标准品的构建
一般荧光定量的基本的计算如下

一、用标准曲线法定量模板浓度
用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。

二、外标准品的制备
（1）化学合成目的基因，它的优点是纯度高、定量准确，缺点是受化学合成工艺的限制，只能合成120bp以下的长度。
（2）将PCR扩增产物直接梯度稀释，它的优点是方便、简单，缺点是不准确、不稳定，容易造成污染。
（3）将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量，它的优点是稳定、准确。
我们实验室都用第三种方法，相对简单、便宜。

三、质粒 拷贝数的计算
拷贝数＝（质量÷分子量）×6.0×1023。
（1）每个碱基的平均分子量是324.5，质粒的分子量是324.5*3560*2=2310440，10μg质粒的摩尔数是10/2310440/1000000=4.328e-12，一摩尔等于6.023e+23，则10μg质粒有4.328e-12*6.023e+23=2.607e+12拷贝。
（2）一对碱基的分子量为660Da，重量为1e-15μg，则10μg质粒拷贝数=10/（1e-15*3560）=2.7e+12分子。
（3）例如pGEM-T 载体长3003bp，插入的目的片断长162bp，每个碱基的平均分子量是330，（每对碱基/bp是660，）质粒原液约250μg/mL，阿弗加德罗常
数（每mol 的微粒数）是6.02×1023/mol。那么每2μl 的绝对模板数量是：

=14.4×1010
所以，10-4~10-7 质粒的模板分子数是14.4×106~103。

四、 结果计算
在实时定量PCR 技术中，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct 值。因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

北京-Maria

收藏学习了，我觉得可以把主帖看做一个标准品构建与溯源的SOP，后面的跟帖是修改意见，如果能够完善成让行业内都认可的SOP，就功德无量了

ty10086

顶一个。学习了~可以看看

空气带点绿

标准品溯源是个难题，尤其是在没有国家标准物质和参考程序的情况下

suraval

标准品溯源是个非常麻烦的事情。源的确定已经不是一个简单的事情了，还要继续确认如何追溯，如果把一级一级的传承关系搞清楚了，这个事情看着会简单很多，但是做好却很难。需要储备大量的背景知识，有丰富的经验，是个需要慢慢摸索的过程

slzs04

标准品溯源是个难题

laura102

嗯~对标准品溯源还属于看起来简单的阶段。就是一级一级的测定，传承

逍遥鱼

呃。。。。不明觉厉。。。不算灌水吧

圆子

标准品的溯源，什么才是最可靠的源泉？溯源条件的判定标准是什么？溯源问题要怎么解决，是不是所有的指控和定标都有溯源文件？这个以后应该会越来越完善吧!

lovekey00

必须做但是难做的事

bobcatmm

标准品溯源是很难做的，如何制定溯源的操作方法、标准等等。而且每种物质的方案都是不太相同的，就意味着要做很多验证

非诚勿扰孟非

外购大家都是走的什么途径？希望多分享经验。

芸豆荚

如何控制住标准品和质控品的稳定性，有经验吗？

wolf

芸豆荚 发表于 2013-11-28 13:34
如何控制住标准品和质控品的稳定性，有经验吗？

冻干之~~

luheizi

没有参考品和参考程序的如何溯源，有统一的标准就好了

灵响

谢谢楼主的无私奉献

大v

学习了。谢谢。。

jodebouch

外标的溯源有没有资料？

仙人掌

这种是我想要的资料，很好

zwxlovezl

无标的标准品如何构建及朔源，头大