知识分享 | 核酸提取基础篇（一）

临床医师

核酸提取是从复杂生物样品中分离提取出DNA或RNA分子，以获得纯净的核酸样本。
核酸提取通常是开启分子生物学研究的第一步，提取核酸的质量高低是决定下游实验成败的关键因素之一。无论后续的PCR、q-PCR、克隆、建库测序等实验都需要核酸才能顺利进行。
在核酸提取过程中，一方面要保证满足下游应用的纯度、浓度、得率的要求，另一方面也要尽量避免造成核酸断裂和降解的各种因素，以保证核酸的完整性，为后续的实验打下基础。
今天我们就来简单了解核酸提取的分类、提取原则、提取步骤、常规核酸提取方法对比及涉及的样本类型等基础知识。
PART ONE  分类

从待提取的核酸类型来看，核酸提取实验可分为DNA提取、RNA提取和DNA＆RNA共提三个大的方向。
01 DNA提取

广泛应用于各种生物学研究及临床诊断领域。在实验过程中，为得到纯净的DNA，需在提取过程中加入RNase以降解样本中的RNA，从而得到比较纯净的DNA。
FireGen FFPE组织RNA提取试剂盒（磁珠法）——采用独特的无二甲苯的脱蜡配方裂解释放石蜡切片组织中的微量DNA，适用于临床检验中肿瘤组织基因突变检测、个性化药物疗法的诊断等核酸类检测项目的样品前处理。
02 RNA提取
可分为总RNA提取和miRNA提取两种，主要用于基因表达分析、RNA测序、siRNA合成与功能研究、RNA相互作用研究、分子诊断等。
03 DNA&RNA共提

一般用于基因结构和功能研究以及基因诊断等领域，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。
FireGen病毒DNA/RNA核酸提取试剂盒——适用于多种临床样本病毒总核酸的提取，可直接用于下游分子生物学实验，包括酶切、PCR、反转录、RT-PCR、芯片检测等。
PART TWO 原则

01 保证核酸一级结构的完整性；
02 保证核酸纯度，降低或排除杂质干扰：

• 其它核酸分子（e.g.提取DNA时需排除RNA的干扰，反之亦然）
  
• 其他大分子（e.g.蛋白质、多糖和脂类分子等）
  
• 对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子
  

PART THREE 步骤

• 样品准备：根据样品特性进行样品准备。
  
• 细胞破碎：细胞破碎有各种方法，包括物理方法（超声波法、匀浆法、液氮研磨等）、化学方法、酶法等。
  
• 核酸的分离与纯化：去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子和其他不需要的核酸分子；
  
• 核酸的浓缩、沉淀：乙醇沉淀是最常用的核酸浓缩、沉淀方法。
  

PART FOUR 提取方法

从核酸提取方方法看，目前常见的核酸提取方法有三种，其原理、优势等对比信息如下：



常见核酸提取方法对比

PART FIVE 样本类型

核酸提取中，根据样本种类的不同，通常需要采用不同的方式对样本进行处理，才能得到纯度更高的核酸。因此，无论在产品研发还是产品使用过程中，都需要根据样本的特性选择合适的样本前处理方式，并以最优的反应体系进行核酸提取工作。



常见核酸提取样本类型

01 常见动物样本——血液、动物组织、培养细胞等
此类型样本细胞数量较多，样本成分较为单一，但处理方式也有些不同。

• 血液：可使用不同抗凝剂的抗凝管进行采集和保存，避免反复冻融。哺乳动物的DNA因存在于有核的白细胞中，所以提取前需对无细胞核的红细胞进行分离或裂解。
  
• 动物组织：一般-20℃可保存1-3个月，-70℃长期保存；福尔马林固定时间8-24h内为宜，样本存放时间不宜超过1年。
  
• 细胞样本：贴壁细胞则需胰酶消化处理再做收集，悬浮细胞需要离心弃上清。
  

02 其他动物样本 ——血清/浆、鼻咽拭子、痰液、腹水、病毒、支气管/肺泡灌洗液、粪便、FFPE组织样本等
此类型样本细胞数量较少、成分相对复杂，在采样和保存途中通常需特殊的保存液，抑制核酸酶对样本的降解作用，才能保证实验有较高的成功率。
其中FFPE样本需先用二甲苯或矿物油类进行脱蜡处理。

03 植物样本——普通植物样本和多糖多酚类植物样本

• 普通植物样本如小麦、玉米、水稻等存在细胞壁结构、内部还有液泡、叶绿体等细胞器结构，成分相对复杂，提取前应使用液氮研磨，研磨充分同时保证样本处于低温条件下避免DNA降解。
  
• 多糖多酚植物样本如水果果肉、植物种子等因内含的多糖与核酸理化性质一致、多酚氧化后易于核酸结合，影响DNA的提取，通常在提取过程中需要用专门试剂对多糖多酚去除后才能得到较高纯度DNA。
  

04 微生物样本——细菌样本和真菌样本

• 细菌样本含有细胞壁，有的还有鞭毛和荚膜，提取前需用溶菌酶做破壁处理，如金黄色葡萄球菌加入一定量的溶菌酶在37℃条件下孵育30min就可完成破壁的处理。
  
• 真菌样本存在以多糖为主的细胞壁、细胞内部成分相对复杂，通常也需酶解破壁或液氮冻融或超声裂解再提取核酸。
  

05 环境样本——土壤、污水等
需根据环境样本的性质，去除相关杂质后再进行核酸提取的步骤。

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