western blotting实验原理及步骤

非诚勿扰孟非

WB，(Western blotting),中文名蛋白质印迹，又称免疫印迹(immunoblotting)，用于检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
比如说你要用大肠或者酵母表达某种目的蛋白，把基因克隆到宿主后，要检测的目的蛋白的表达就可以用western blot
总体来说有5个步骤，蛋白电泳，转膜，封闭，加抗体，以及检测。
1.蛋白电泳—蛋白根据分子量大小分开
SDS（负电）-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
分子量大的跑得慢，在胶的顶部，分子量小的跑得快，在胶的底部（电泳速度与分子量大小、电荷量和蛋白结构有关）
蛋白上样缓冲液：
SDS，可使得蛋白裹上足量的负电荷，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异；
DTT还原剂，可打开巯基维持单链的线性结构，并且通过煮沸仅保留一级结构，消除了结构差异；
甘油，可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部，不会逸散至加样孔以外；
溴酚蓝，小分子蓝色物质，在最下面的位置，有指示作用：当它刚好跑出最下方玻璃板时，就可以结束电泳了。
2、转膜（膜与蛋白有高度亲和的能力）
因为蛋白位于胶的内部，所以要将蛋白从胶内部转移到膜表面，使抗体更容易和蛋白结合。
常用的两种：NC硝酸纤维素膜和PVDF（聚偏氟乙烯）膜
电场垂直于凝胶和膜：所以凝胶中的蛋白（带负电）向紧贴着凝胶的膜上转移，最终吸附在膜的表面
滤纸：维持transfer buffer稳定流动。
里面会加甲醇：当蛋白从凝胶中出来后，使蛋白与SDS分离，阻止其继续移动，从而更好地与膜结合。
3.封闭—封闭膜的空白结合位点，防止添加的抗体吸附在除目标蛋白外的膜上的其他位置（且很难洗掉），否则最终会显示出非特异性条带、杂带、高背景等，不仅浪费抗体，还影响判断。
脱脂牛奶或BSA胎牛血清。虽然也会在一定程度上吸附到目标蛋白上，但都属于非特异性的结合，很容易在后面的漂洗中消除
4.抗原抗体免疫反应
1）一般先加一抗：与蛋白特异性结合，常用的孵育时间和温度是4℃摇床过夜赋予（温度适宜，分子运动温和）。洗膜：未结合一抗洗掉。
2）二抗：被HRP辣根过氧化物酶标记（可与发光底物相结合）的抗体：可结合多个二抗，放大信号。同样也是孵育后洗膜
5.蛋白检测

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