要去读博了，哪里有培训细胞培养，免疫组化，western blot, PCR等实验基础操作?

千姿百态

要去读博了，哪里有培训细胞培养，免疫组化，western blot, PCR等实验基础操作?
原文地址：https://www.zhihu.com/question/491700476

感恩由您

师妹：“培养基要怎么选择？”
师弟：“啊！我的细胞是不是要死翘翘了？！！”
小白：“细胞计数要怎么操作呢？要去数数吗？”
师兄：……
萌 Cece：莫慌莫慌，如果你也有类似的烦恼，今天就让小 M 带你清除细胞培养的疑难杂症，不再为小小细胞烦恼~

<hr/>1 接受细胞：和细胞的初次相遇


和细胞第一次见面的时候我们要做好什么准备呢？快跟着小M 一起看看吧~
▐ 01 记录细胞重要信息

当第一次在实验室接收细胞系时，有几条与细胞系有关的信息应该被整理和记录，这些将确保细胞系的成功繁殖、扩增、冷冻保存和储存。小 M 强烈建议在细胞扩增开始之前记录以下信息：
(1) 背景信息，(2) 传代培养，(3) 冷冻保存，(4) 细胞系储存。

表 1. 需要记录与细胞系有关的信息[1]。

注意：细胞培养时，连续细胞系在培养中会发生变化。然而，许多研究已经证明了长期培养对细胞系形态、发育和基因表达的各种影响：如细胞生长变异，导致细胞污染等。因此，当第一次将细胞系接收到实验室时，留有低传代的细胞种子库是非常重要的。

▐ 02 培养细胞的形态观察

监测和记录细胞形态和行为是十分重要的，推荐做法是在传代培养之前定期仔细地检查培养细胞，以确定其状态和健康状况。细胞形态观察结果可以帮助“科研汪”们判断 (1) 细胞的形态：健康 or 恶化 (即衰老或坏死的细胞)？(2) 是否存在细胞污染？(3) 区分细胞及细胞密度。
大多数细胞培养生长为：悬浮培养和贴壁培养。然而，在某些情况下可能会观察到悬浮和贴壁的混合群体。  



培养中的动物细胞的形状可分为三个基本形态：成纤维细胞样(Fibroblast-like)、上皮细胞样(Epithelial-like) 和类淋巴母细胞样(Lymphoblastoid-like)。




图 1. 培养细胞的一般特征和形状[1]。

(A) 上皮样 (贴壁)；(B) 成纤维细胞样 (贴壁)；(C) 淋巴母细胞样 (悬浮液)。

<hr/>2 细胞处理：具体操作指南！


(以收到 T25 培养瓶为例)
1. 先观察培养基颜色以及是否有漏液情况，再在倒置显微镜下观察细胞状态，并对细胞进行不同倍数拍照，排除细胞本身污染或状态不好的情况；
2. 确认细胞状态正常后将细胞瓶外壁消毒，放在培养箱静置数小时 (根据细胞密度定) 以稳定细胞状态；
3.1 贴壁细胞：细胞生长密度超过 80% 时，可根据情况传代，若细胞未超过80%汇合度时，可对其培养基进行半换液处理，即吸去一半的原培养基 (不要丢掉可以留给细胞过渡用)，再加入等量的完全培养基继续培养，直至细胞密度超过 80% 以后再进行传代；
3.2 悬浮细胞：将细胞培养瓶内液体转移至离心管，500 g 离心 5 min，温柔的倒出上清液 (也可以先保留下来以备不时之需)，管底细胞沉淀加入 10 mL 完全培养基吹打、重悬。放入新的细胞培养瓶中培养过夜，根据细胞密度及生长情况分瓶传代。



图 2. 台盼蓝染色图[2]。

4. 细胞计数：无血清培养基将细胞悬液稀释到 200-2000 个/毫升，在 10-100 µl 的细胞悬液中加入等体积的 0.4% 的台盼蓝溶液。轻轻混匀，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼蓝，依旧是透亮的状态，死细胞会被染成蓝色。有细胞计数仪的，可直接用计数仪进行计数更方便哦~
<hr/>3 培养基选择：给细胞吃“饱”适当“加餐”


选择合适的培养基对于细胞培养的成功至关重要，不同类型的细胞具有不同的生长需求和特定的培养条件。
首先，培养基中的营养物质是维持细胞生长和代谢所必需的。不同类型的细胞需要各种不同的氨基酸、糖类、维生素、无机盐和脂质等营养物质以满足其生理需求。如果培养基中缺乏必要的营养物质，细胞可能无法正常生长和分裂，甚至会导致细胞死亡[3][4]。
选择合适的培养基的时候优先根据细胞来源公司提供的培养条件，无法确定来源的可以参考 ATCC 推荐细胞对应培养基。

表 2. 常见细胞的培养体系。

其次，不同类型的细胞需要特定的生长因子和激素来维持其特定的功能和特性。例如，神经细胞培养基中通常添加神经营养因子 ，以促进神经细胞的生长和突触形成；胎牛血清 通常被添加到培养基中，提供细胞所需的生长因子、蛋白质和其他重要组分。
此外，必要时候也可以加入抗生素来防止污染保卫细胞。例如双抗 (青霉素/链霉) 甚至三抗 (青霉素、链霉素、两性霉素 B) 以抑制细菌和真菌等微生物的生长，青霉素-链霉素可有效抑制多数革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌的生长，两性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。
4 细胞传代：细胞也要“传宗接代”


随着时间的推移，细胞的数量会增加，而空间和资源却有限。所以，当细胞达到一定密度时，就该考虑给他们一个更广阔的居住空间，让他们继续昌盛繁衍。




图 3. 传代流程图。

常见的细胞传代步骤参考如下：
(以 T25 培养瓶为例)
1. 从培育箱中取出细胞，显微镜下观察细胞，汇合度大于 80% 即可传代；
2. 准备操作：培养基和 PBS 放置 37℃ 水浴锅预热，将传代所用耗材(移液管、移液枪、T25 培养瓶、枪头等) 放入超净工作台，紫外灭菌 30 min 后通风，将胰酶和预热后的培养基以及 PBS 用 75% 酒精消毒后放入超净工作台；
3. 吸弃培养瓶内旧培养液，5 mL PBS 润洗细胞，吸弃 PBS；
4. 加入 1 mL 胰蛋白酶，轻晃培养瓶使胰蛋白酶充分覆盖细胞，放入 37℃ 培养箱中孵育 30 s-2 min (实际孵育时间因所使用的细胞系而异)；
5. 显微镜下观察，当 ≥90% 的细胞脱落时，加入两倍胰酶体积的含血清的完全培养基，终止消化，吹打细胞层表面数次，使其分散成单个细胞；
6. 500× g 离心 3-5 分钟，将细胞沉淀重悬于含血清的完全培养基；
7. 将细胞悬液按传代比例分装到培养瓶，补充新鲜完全培养基，轻晃培养瓶使细胞分布均匀，并做好标记；
8. 显微镜下观察细胞密度及状态，把细胞送回培养箱。
注意：利用胰蛋白酶进行动物细胞传代培养时需要考虑许多因素。胰蛋白酶具有水解蛋白质的活性，可影响细胞的多种生理代谢功能。
Tips：胰蛋白酶传代培养细胞的最佳方法

• 在添加胰蛋白酶之前，用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的生理盐水/PBS 清洗，以去除这些离子 (溶液中的 Ca2+、Mg2+ 和血清会降低胰酶活力)；
  
• 用最低浓度和体积的胰蛋白酶从培养瓶表面去除细胞；
  
• 如果可能的话，在室温或更低的温度下使用胰蛋白酶溶液，以减少酶的内吞作用；
  
• 尽可能短的时间使用胰蛋白酶处理细胞，避免消化过度影响细胞；
  
• 用胰蛋白酶抑制剂如含血清或血清的完全培养基中和终止胰蛋白酶活性，然后用离心除去胰蛋白酶；
  
• 细胞脱落后立即离心除去培养瓶表面的胰蛋白酶。
  

<hr/>5 细胞冻存 & 复苏：让细胞“永葆青春”


细胞冻存就像是给细胞一个冰冻的时间旅行机票，保证它们在未来可以“解冻”回到活力四溢的状态。这一过程可以确保你的珍贵细胞库不会因为时间的推移而遭受损失。
那么冻存细胞的最佳时机是什么时候？什么样的细胞浓度合适？要用多少冻存液呢？怎么实现细胞的“慢冻”？复苏后第二天发现细胞没有活？好不容易复苏的细胞竟然污染了？怎么才能让细胞满血复活呢？

关于这些问题小 M 在往期推文中已经为大家整理过了，本期不再赘述。详情可见往期推文：干货分享 | 细胞冻存与复苏避坑指南 ( 不看后悔 !!!）
今天小 M 和您的细胞之旅就到这里啦，我们下次见~
<hr/>相关产品


Fetal Bovine Serum (FBS)

Fetal Bovine Serum (FBS)特级胎牛血清，乌拉圭

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES)

细胞培养常用培养基

DMEM (Low Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES)

细胞培养常用培养基

RPMI 1640 (L-Glutamine, Phenol Red, no HEPES)

细胞培养常用培养基

BM-Cyclin 支原体清除试剂

有效抑制和清除在细胞培养中广泛存在的支原体污染

Penicillin-Streptomycin

双抗，可以对许多细菌引起的污染进行有效的控制

0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red

用于细胞解离、常规细胞培养传代及原代组织解离，使组织或贴壁细胞分散成单个细胞

<hr/>参考文献

[1] Reid YA. Best practices for naming, receiving, and managing cells in culture. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017 Oct;53(9):761-774.
[2] Aung S M, et al. Live and dead cells counting from microscopic trypan blue staining images using thresholding and morphological operation techniques[J]. International Journal of Electrical and Computer Engineering, 2019, 9(4): 2460.
[3] Jessica Cox, et al. Co-occurrence of Cell Lines, Basal Media and Supplementation in the Biomedical Research Literature. Journal of Data and Information Science. 2020, Vol. 5. Issue (3) : 161-177.
[4] Lee JT, et al. Cell culture medium as an alternative to conventional simulated body fluid. Acta Biomater. 2011 Jun;7(6):2615-22.
[5] Yee Y, et al. Mechanism of penicillin-streptomycin synergy for clinical isolates of viridans streptococci[J]. The Journal of infectious diseases, 1986, 154(3): 531-534.
[6] Baust, et al. Development and Assessment of a Novel Device for the Controlled, Dry Thawing of Cryopreserved Cell Products. BioProcessing Journal. 2016;15. 30-41.

继续前进

导师强烈安利的这几个网站，查找实验Protocol，十分靠谱！
一、Bio-protocol

网站：https://bio-protocol.org/cn
目前最完善的生物技术收集站之一,主要集中于生命科学领域，支持中文检索。


二、Cold Spring Harbor Protocols

网址：Cold Spring Harbor Protocols
大名鼎鼎的冷泉港实验室，首页领域分类一目了然。每个月一期详细介绍了多种基本方法——混合了前沿和成熟的技术，部分免费。


三、JOVE

网址：https://www.jove.com/cn/
每月出版一期，每期约70个视频（每个视频配有一篇文章），可回溯至2006年，视频每日更新，全新推出中文主页。


四、Nature Protocols

网址：https://www.nature.com/nprot/
大规模对接的使用指南，实验方法非常详细。


五、Springer Nature Experiments

网址：https://experiments.springernature.com/
收集了来自Nature Protocol、Nature Reviews Methods Primers、Nature Methods和Springer Protocol的实验方法和Protocol。


六、Current Protocols

网址：https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/
成为全球最佳实验室指南，所有内容都被PubMed和Scopus收录。


七、Protocol exchange

网址：https://protocolexchange.researchsquare.com/browse
是Nature Protocols赞助的开放性平台，并免费提供给科学界使用和评论。
点击“Browse（浏览）”，关键词进行检索。如果需要使用高级检索，可以点击“More Filters”，通过标题、作者、学科领域、日期等进行限定检索。


如果对你有帮助的话，就点个赞吧。每天更新更新科研工具，主打一个实用，欢迎关注我 @爱科研的猫喵

感恩由您

免疫学必备三件套：蛋白质免疫印迹（WB）、免疫组化（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA），分别应用于定性、定位和定量。
其中免疫组化实验，广泛应用于基础研究和临床病理诊断，在基础研究中可用于确定细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的分析，在临床病理诊断方面，可用于判断肿瘤的来源、分类和鉴别诊断及评估临床治疗。
今天梳理下免疫组化（IHC）实验的分类、实验操作，以及应用实例的一些重点内容。萌新打好基础，老手巩固知识！
最全的生物实验protocol与生物实验操作视频学习资料合集
112个科研软件免费版（数据处理+绘图+翻译+生物实验相关等）
下载链接：https://pan.quark.cn/s/34a75dd2241d

一、免疫组化原理

1.免疫组织化学技术 / IHC
IHC是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。通过带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞与对应组织结合化学反应显色，对其进行定位、定性及定量的研究。
标记物→显色


2.免疫组化分类

• 酶---免疫酶组织化
  
• 荧光素---免疫荧光组化
  
• 胶体金---免疫胶体金组化
  
• 高亲和力物质---亲和免疫组化
  

①免疫酶组化
以酶标记的抗体与组织作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物，通过光镜对细胞表面和细胞内的抗原进行定位定量。
特点：信号定位准确 ，标本可长期保存，易于检测阳性标记与病变关系，方法简便，易推广，是目前最常用的技术。


免疫酶组化-食道鳞癌CK5/6染色并HE复染，肿瘤细胞胞质阳性。


<hr/>②免疫荧光组化
用荧光素标记的抗体检查组织内相应抗原。抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射即会发出特定波长的荧光，在荧光显微镜下可对抗原定位或定量。
特点：特异性强、灵敏度高、快速简便，应用较广。


皮肤组织免疫荧光组化
利用荧光标记的抗补体抗体进行免疫荧光染色
箭头指示表皮与真皮的交界有免疫复合物存在
③免疫胶体金技术
1）用胶体金标记的抗体作为探针，对抗原进行定性、定位，或定量研究。
2）胶体金是指金的水溶胶，能迅速而稳定地吸附抗体而不影响抗体活性。
特点：胶体金有不同大小的颗粒，且电子密度高，所以特别适合于电镜的定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。


免疫胶体金染色，人结肠癌石蜡切片，胶体金标记COX IV抗体
④亲和免疫组化
利用两种物质间高度亲和特性及可标记性，将酶等标记物连接到亲和物上，以对待检物进行检测。
特点：灵敏度高，有利于微量抗原在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。


免疫亲和组化，人胃癌石蜡切片
鼠抗人Wnt-2一抗，亲和素-HRP染色，苏木精复染(蓝色).
<hr/>二、免疫组化实验步骤

1.免疫酶组化步骤
1）标本制备




2）免疫染色




3）数据获得（观察）


<hr/>三、免疫组化应用实例

1.IHC实例I-单染
IHC抗MISIIR抗体对异种移植肿瘤切片染色，DAB显色，根据密度评分以评价表达量。


Sarah E. Gill，Oncotarget, 2017

• IHC实例II-单染细胞定位
  

兔肝脏石蜡切片。Ki67 （棕色）及HE复染。圆圈指示阳性细胞，箭头指示淋巴细胞。


van der Loos et al. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 2013
<hr/>3.IHC实例 III-双染指示位置关系
S-100 神经特异性蛋白 红色; AE1/3 鳞状细胞标志物，棕色
鳞状细胞（棕色）包绕神经束膜内（红色）,部分侵入束膜


Berlingeri-Ramos et al.Journal of Skin Cancer. 2015
4.IHC实例 IV-双染指示特定细胞表达
免疫组化双染标记大鼠结肠石蜡切片。指示巨噬细胞内iNOS表达。
1）CD68-巨噬细胞标志物
2）iNOS-诱导性NOS


Isidro et al，Histochem Cell Biol. 2016
<hr/>5.IHC实例 V-三染
①Shh-细胞损伤标志物
②K8/18及Ub指示细胞膨胀
③SMA-成肌纤维细胞标志物
④Sox-9-前体细胞标志物
⑤Gli-2-Hh通路活化标志物
1）K8/K18（棕色）和Ub（紫红色）双阳性肝细胞
2）α-SMA （棕色）, gli-2（红色）和sox-9 （蓝色）三阳性细胞


Guy et al. Hepatology. 2015
<hr/>×200
6.IHC实例 VI-荧光三染
①SMA-647 纤维细胞标志物
②Catenin –568 钙黏蛋白
③Actin-FITC 细胞骨架
④DAPI-细胞核
小鼠肠组织切片，免疫荧光三染


Goodpaster and Habecker，Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2014
免疫组化是个苦活，耗费时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。想染出了漂亮的片子和实验结果就必须要有正确的实验思路和操作方法。




推荐内容

绝密！2023年国自然立项清单表可下载（生命科学部+医学科学部），附往年1000+份中标标书！
如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告？
有哪些好用的zotero插件?
有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具？
有没有什么很好的科研作图软件？
顶级图像分析软件，Image J、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定！
NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用？（附安装包）
2023年更新！EndNote X9永久激活版本（序列号激活），最稳定，可汉化！
写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！
太牛了！Zlibrary回归，这里有最稳定的访问指南！
western blot是为了什么？
如何学习和记忆细胞信号通路？
最值得推荐装！GraphPad Prism 9.3 ，功能更多！
SPSS 27 安装激活，授权日期到期时间2037年

长长的路

可以看一些实验protocol网站，搜索你想看的关键词即可，基本上都会有题主提到的这些：
英文的：
1、bio-protocol
Bio-protocol Journal- Improve Research Reproducibility
Bio-protocol Exchange, a platform for researchers to find, share and discuss life science protocols
Bio-101 - Improve Research Reproducibility (bio-protocol.org)
2、Springer Nature Experiment（Nature旗下的所有protocol）
Springer Nature Experiments - Over 80,000 Protocols and Methods
3、Current Protocols
Current Protocols - Wiley Online Library
4、Cold Spring Harbor Protocols（分子生物学实验）
Cold Spring Harbor Protocols (cshlp.org)
5、Protocol Exchange
Home | Protocol Exchange on Research Square
6、Jove（视频Protocol，需要会员）
JoVE | Peer Reviewed Scientific Video Journal - Methods and Protocols
7、Nucleic Acids Research Methods
NAR methods new | Nucleic Acids Research | Oxford Academic (oup.com)
8、STAR Protocols
STAR Protocols: Cell Press
9、Methods and Protocols（里面不只有生物医学的Protocol，还有其他学科的）
Methods and Protocols | An Open Access Journal from MDPI
中文的：
1、MedPeer（实验视频可以在实验技术里找到）
实验方案首页-MedPeer
实验技术详情-实验技术-MedPeer
这里面比较推荐有视频的MedPeer和Jove，对于新手来说，看视频才是最直接的。当然如果你在读博之前能进实验室学更好，你的博导应该会提前让你进实验室的（如果是国内的话），到时候跟着师兄师姐学也可以，不过还是在做之前自己提前查好资料做好预习比较好。不过本身研究生课程里也会有实验课，国内外都是这样，也可以入学之后跟着课程学。

清风寡欲

分享大家一些实验技术网站，主要是帮大家拓展学习思路打开学习视野。
一、国外网站

1、冷泉港实验手册

冷泉港实验室负责人是DNA双螺旋结构图的发现者之一沃森，被称为DNA之父，冷泉港DNA学习中心也是全球最有影响的生命科学教育基地。里面内容很多，都提供有详细的操作步骤，并且提供全文下载。


2、Bio-protocol

Bio-protocol创办于2011年，他们打造的是一份专门出版实验技术的期刊，鼓励大家将论文中的实验方法进行开发共享，从而促进实验的可重复性和技术交流。


3、protocols.io

这也是国外一个非常专业的实验方案开放交流平台，与前面bio-protocol和JOVE不同的地方，你可以根据别人的实验方法通过复制、创建分支等方式创建属于自己的实验方案，页面交互非常流畅，颜值是目前我所知同类网站中最高的。


4、JOVE

该网站主打特色是提供实验介绍的视频，同样也是一个出版step-by-step实验方案的期刊。根据网站介绍目前已有超过1万多实验技术视频。在页面底部可以看到网站提供的教育资源。比如JoVE Lab Manual模块就提供了很多卡通动画，很适合课堂教学。


二、国内网站

1、中国实验动物信息网

中国实验动物信息网是由国家科技部批准成立的国家实验动物数据资源中心(挂靠广东省实验动物监测所)运行管理的公益性、综合性网站，是目前国内最大的实验动物行业类门户网。


2、MedPeer-实验技术
这个网站比较适合实验室小白入门。比较有特色的是他们对每一项实验技术做了历史发展梳理，并且还有很多实验视频介绍。