ELISA实验——原理、步骤、注意事项、示例图

青草

一、实验目的

1. 检测生物样品中抗体、抗原、蛋白质和糖蛋白等物质的含量。
2. 药物药效学评价、筛选。
二、ELISA实验原理

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术，由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971年首次描述。该测定依赖于抗原-抗体相互作用的原理，并利用酶和比色检测来量化目标分子，主要用于检测和量化生物样品中特定蛋白质、肽、抗体或抗原的存在。ELISA测定通常应用于各个领域，包括临床诊断、药物研究和生命科学基础研究。



图1 ELISA原理图及分类 源自Excedr官网

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种：
直接ELISA：抗原通过一段时间的孵育被动地附着在塑料固相载体上，经过简单的洗涤后，通过添加与酶共价连接的抗体来检测抗原。孵育和洗涤后，通过添加色原/底物使酶活性产生颜色变化来显色。在规定的时间后通过化学手段终止酶活性后读取显色情况。在分光光度计中读取颜色。该方法相对简单，但它在灵敏度方面可能存在局限性，特别是当抗体-抗原相互作用相对较弱时。
间接ELISA：间接ELISA是在直接ELISA的基础上添加酶标二抗进行检测。抗原通过孵育被动附着到孔上，洗涤后，将抗原特异性抗体（一抗）与抗原一起孵育。 清洗孔并通过添加与酶共价连接的抗物种抗体（二抗）来检测结合的抗体。二抗对于产生所添加的第一抗体的物种具有特异性。



图2 间接ELISA步骤 源自RayBiotech官网

夹心ELISA：将捕获抗原的抗体（捕获抗体）附着在固相载体上，洗掉多余的未结合抗体后，添加抗原并被特异性捕获，通过直接ELISA或间接ELISA的形式检测抗原。这种组合进一步提高了检测的灵敏度和特异性，是最常见的ELISA实验形式。



图3 夹心ELISA步骤 源自RayBiotech官网

竞争性ELISA：在竞争性ELISA中，固定量的标记抗原与样品抗原（样本）竞争与固定化抗体的结合。信号与样品中抗原的浓度成反比。



图4 竞争ELISA分类及步骤 源自RayBiotech官网

三、仪器和试剂

ELISA试剂盒（本文以人IL-2作为检测对象举例说明）、细胞培养瓶、细胞计数仪、台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、移液器、多通道移液器、移液管移液器、10μL-1000μL移液器吸头、酶标仪、去离子水。
若无试剂盒则还需要：微孔板条、IL-2抗体（捕获抗体）、偶联生物素的抗人IL-2抗体（检测抗体）、链霉亲和素-HRP（HPR，辣根过氧化物酶）、包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、四甲基苄啶溶液（TMB，显色液）、硫酸溶液（终止液）、人IL-2蛋白标准品、PBS、吐温-20、牛血清蛋白（BSA）、透气封板膜。
四、实验步骤

1. 样品准备
a. 细胞上清样品，需将培养瓶内的细胞消化离心取上清即可（如800g，5分钟）。
b. 血清样品，将全血收集至不含抗凝剂的试管内，在室温下放置1小时，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1500g离心10分钟，取黄色上清即得血清。
c. 血浆样品，将全血收集至含抗凝剂的试管内，混匀后置冰上，4℃约1500g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆。
2. 确定样品测试组、标准品和空白组组所需的微孔条数量，每个浓度做两个平行重复，从支架上取出对应数量的微孔条，剩余储存在箔袋中，密封后在4℃储存。
3. 配制对应浓度的捕获抗体溶液、检测抗体溶液、包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、链霉亲和素-HRP（若使用试剂盒则没有此步骤或按试剂盒要求配制）。
4. 每孔加入100μL 捕获抗体溶液，用封板膜覆盖，4℃孵育过夜，过夜后舍弃舍板内溶液。
5. 每孔加入300-400μL洗涤液清洗五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干（若使用试剂盒则没有步骤4和5）。
6. 用样品稀释液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀释样品，以此确定样品IL-2的最佳检测浓度。
7. 配制梯度浓度的IL-2蛋白标准品，将工作浓度设置为1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL, 18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此浓度来绘制标准曲线。
8. 分别将样品、标准品、样品稀释液按照100μL/孔加入相应孔中作为标测试组、标准品组、空白组。
9. 将偶联生物素的抗人IL-2抗体按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆盖，室温避光孵育2小时。
10. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
11. 在所有孔加入100μL稀释后的链霉亲和素-HRP，用封板膜覆盖，室温避光孵育1小时。
12. 每孔加入300-400μL洗涤液洗板五次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
13. 在所有孔中加入100μL TMB显色液。用封板膜覆盖，室温避光孵育30min。
14. 在所有孔中加入终止液50μL，混匀后立即测量A450值。
15. 计算每一组重复的标准品和样品的平均吸光度值。重复次数应在平均值的20%以内。
16. 绘制IL-2标准品标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
17. 结果示例图：



图5 不同实验条件处理后的NK细胞产生的IFN-γ和TNF-α含量对比[1] Zhang PF, Mol Cancer. 2020;19(1):110. Published 2020 Jun 27. doi:10.1186/s12943-020-01222-5



图6 不同模型小鼠体内在不同时间的磷酸化STAT3的表达水平[2] Allen MJ, J Nutr. 2014;144(8):1306-1313. doi:10.3945/jn.114.194407



图7 左图为免疫小鼠血清中抗sFGL1抗体的滴度，右图为小鼠腹水中2D7和4G7的抗体滴度[3] Zhang X, Front Immunol. 2021;12:670626. Published 2021 Apr 23. doi:10.3389/fimmu.2021.670626

五、注意事项

1. 对于血清样本不要剧烈摇晃以免溶血，且不能添加任何防腐剂或抗凝剂。在吸取时注意不要吸取白色或淡黄色沉淀，制备好的血清需置于冰上待用。
2. 若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。所有样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。不能使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
3. 对于血清或血浆样品，可以加入50μL样品分析缓冲液后加50μL样品；如稀释比例大，将样品与样品分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100μL。请注意记录好样品的稀释倍数。
4. 请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于检测限，请适当稀释或浓缩后再进行检测。
5. 如果是手洗板，注意洗涤液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，会造成背景值增高。
6. 特别注意：设计实验的时候要考虑实验孔的位置，保证甩掉洗涤液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开最好。同时注意甩掉洗液的动作翻转（从正上方旋转120-150度）要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体！甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。
7. 拍干最好用干净的吸水纸、滤纸或无尘布，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大
8. 复孔的吸光值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。
9. 每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值（如果没有做校正孔，则不需要减去）。
10. 实测数据会因试剂盒供应商、试剂供应商、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，因此每次实验都要重做标准曲线，供应商给提供的标曲用作辅助参考（如图9）。



图8 三家不同供应商IL-2 ELISA试剂盒提供的IL-2蛋白标准曲线

11. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。
12. ELISA结果图有多种展现形式，不拘泥于一种，选择合适的风格即可。
六、参考文献

[1] Zhang PF, Gao C, Huang XY, et al. Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 2020;19(1):110. Published 2020 Jun 27. doi:10.1186/s12943-020-01222-5
[2] Allen MJ, Fan YY, Monk JM, et al. n-3 PUFAs reduce T-helper 17 cell differentiation by decreasing responsiveness to interleukin-6 in isolated mouse splenic CD4⁺ T cells. J Nutr. 2014;144(8):1306-1313. doi:10.3945/jn.114.194407
[3] Zhang X, Zhu H, Zheng X, et al. A Double-Antibody Sandwich ELISA for Sensitive and Specific Detection of Swine Fibrinogen-Like Protein 1. Front Immunol. 2021;12:670626. Published 2021 Apr 23. doi:10.3389/fimmu.2021.670626

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