培养基的制备

临床医师

实验二
细菌的培养与分离技术
一、培养基的制备
(一)实验目的：
1.掌握常用培养基的制备方法。
2.熟悉常用培养基的种类、用途。
(二)仪器和材料：
电子天平、生物安全柜、电热仪器、高压蒸汽灭菌器、营养琼脂干粉、克氏双糖铁琼脂干粉、无菌平皿、锥形瓶、量筒、试管、报纸、橡皮筋、锥形瓶塞、试管塞、药勺、称量纸、记号笔、毛巾等。
(三)实验步骤：
I.普通平板
①调配：事先用量筒量好200ml蒸馏水，先加入少量水进入锥形瓶，用电子天平称量6.6g营养琼脂粉后将其倒入锥形瓶中混匀，再将剩余的水加入冲洗瓶壁，混匀。
②灭菌：采用高压蒸汽灭菌法灭菌，121.3℃维持15min，灭菌完成待压力表归零后即可取出。
③分装：待培养基冷却至50~60℃，于生物安全柜中无菌操作倾注于无菌平皿内
④检定：
       a.无菌试验：将培养基置35孵育24h，无细菌生长为合格；
       b.生长试验：接种大肠埃希菌于该培养基中，35℃温箱培养24h后观察其生长现象。大肠埃希菌生长良好为测试合格。
⑤保存：制备好并检验合格的培养基，每批均应注明名称、制备日期，置保鲜袋内存放在4℃冰箱。不宜保存过久，一般不超过两周。
Ⅱ 克氏双糖铁琼脂（KIA）
①调配：事先量好200ml蒸馏水，先加入少量水进锥形瓶，用电子天平称量11.0g克氏双糖铁琼脂粉后倒之入锥形瓶中混匀，再将剩余的水冲洗瓶壁。
②溶化：使用电热器将之加热，使各种成分混匀溶解于水中。
③分装：将上述培养基分装于试管内，分装量为试管长度的1/3（量宜多些），加试管塞塞紧，十支为一扎，上端用报纸包住并用橡皮筋扎紧。
④灭菌：采用高压蒸汽灭菌法灭菌，118℃维持15min。灭菌完成待压力表归零后即可取出。
       取出后将试管口垫于毛巾之上，使试管中的培养基形成高层斜面，需趁热斜放，使斜面高度与高层的高度相同，冷却后即成。
⑤检定：待培养基冷却凝固后检定。
       a.无菌试验：将制备好的培养基置35℃温箱培养24h，无细菌生长为合格。
       b.生长试验：分别接种大肠埃希菌和普通变形杆菌于培养基中，35℃温箱培养24h后观察其生长现象。
   若大肠埃希菌：底层和斜面均变黄色；
   普通变形杆菌：底层黄色+黑色（产生硫化氢），斜面为红色，
   则试验合格。
⑥保存：制备好并检验合格的培养基应注明名称、配制的日期等，存放于4℃冰箱，不宜保存过久，一般不超过两周。
四、实验结果：质量检查通过。成功制备数十份普通平皿培养基和50支克氏双糖铁试管培养基。
五、注意事项：
1.给每个平皿分装前均需将锥形瓶瓶口于酒精灯火焰处进行灭菌。
2.培养基须保持澄清，以利于观察细菌生长情况。
3.培养基分装时，不宜超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。
4.高压蒸汽灭菌时间不宜过长。

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