western blot如何确定一抗，二抗？

会里很

western blot如何确定一抗，二抗？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/411625304

感恩由您

简单回答下：WB通常被用来确定样品间蛋白的相对表达水平，还可以确定目标蛋白的分子量大小。一抗是用来与抗原结合的，而二抗主要是是检测一抗。
一抗的选择应该考虑与抗原结合的特异性、亲和力以及标记类型（比如酶标记、荧光标记）；二抗的选择一般依赖于一抗种属的选择，而且二抗一般带有可以检测的标记，比如辣根过氧化物酶（HRP）、荧光素、生物素等，需要跟检测体系兼容。
希望上述回答对你有帮助，也为你推荐一篇技术干货文章，如有需要可以查阅：
曼博生物：什么是in vivo级抗体蛋白？有哪些用途？

感恩由您

确定一抗，二抗的方法有多种途径，看文献，查专业抗体网站，或者问你同事你领导你导师，再不行直接问医药公司的销售和技术支持人员，总有一个渠道可以帮助你确定你需要的抗体。
但是求人不如求己，学到了才是自己的！
一抗、二抗、内参抗体，做实验选抗体，看完这篇再也不求人！
相关内容：实验室祖传！Western Blot 实验全流程步骤+常见问题解决方案！
1.什么是抗体？什么是一抗、二抗

抗体是一种免疫球蛋白，由B淋巴细胞产生。所有的抗体分子都有相似的结构，都是由两条相同的重链（heavy chain，H链）和两条相同的轻链（light chain，L链）组成的4条肽链对称结构。轻、重链的链内和链间分别借助二硫键相连。


简单理解就是抗体是一种特异性很高的蛋白质，可以识别和结合到特定的抗原上，从而形成抗原-抗体复合物。抗体检测利用这种特异性反应来检测体内是否存在特定的抗体。
补充：什么是抗原？
抗原是任何可以在体内引发免疫反应（例如，抗体产生）并被免疫系统产生的特异性抗体结合的外来物质。抗原通常具有高分子量并且通常是蛋白质或多糖。多肽、脂质、核酸和许多其他物质也可以用作抗原。
抗原-抗体相互作用：表位是特异性抗体识别并结合的抗原的一部分。为了抗原和抗体之间的有效相互作用，表位必须易于结合。如果靶分子变性（例如，通过固定、还原、pH变化或在凝胶电泳制备过程中），表位可能会改变，这可能会影响其与抗体相互作用的能力。
例如，一些抗体在蛋白质印迹中可能是无效的，但在免疫组织化学（IHC）中非常好，因为在IHC中可能在组织中维持复杂的抗原位点。相比之下，在蛋白质印迹中，样品制备过程会充分改变蛋白质构象以破坏抗原位点并消除抗体结合。
因此，表位可以存在于抗原的天然细胞环境中或仅在变性时暴露。在其天然形式中，表位可以是细胞质的（可溶的）、膜结合的或分泌的。表位的数量、位置和大小取决于抗体制备过程中可用的抗原量。
1.1一抗

一抗是一种免疫球蛋白，能特异性结合特定蛋白或重点研究的其他生物分子，目的是对其进行纯化、检测和定量。使用小鼠、大鼠、兔子、山羊和其他动物作为宿主，可获得多克隆或单克隆抗体。
一抗的生产和类型有多种形式，从抗血清粗品到抗原纯化制剂不等。



一抗结构

我们常说的抗体指的是第一抗体。市售的一抗有多种不同的生产方式，这些不同导致抗体各具特性，适用于不同的应用。了解每种抗体的特性对选择最合适的抗体至关重要。
单克隆抗体和多克隆抗体都是我们实验中常用的抗体产品。他们在识别的抗原表位、生产和应用等方面有一些区别。

• 多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个 B 细胞克隆产生针对多种抗原表位的抗体。
  
• 单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由单一 B 细胞克隆产生的识别一种抗原表位的抗体。
  

• 对于需要大量的针对相同抗原表位，并且批间差异小的应用（例如治疗药物），单克隆抗体是一个更好的选择。
  
• 但对于普通的科研应用，多克隆抗体比单克隆抗体更有优势。
  单克隆抗体与多克隆抗体的区别：
  

1.2 二抗

二抗用于靶抗原的间接检测。二抗能和抗体结合，简单理解就是抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在。二抗可用于一抗的荧光、显色和化学发光检测，适合各种应用，例如细胞成像、流式细胞检测和蛋白质免疫印迹。
请注意，二抗不与目标蛋白的表位直接结合，也不具有抗原表位特异性（这其实是由一抗决定的）。带有标记的二抗决定了检测方法。



一抗和二抗结合模式图


举个例子：一抗可以特异地结合目标蛋白，但通常需要发光物质或者显色基团标记才能被检测出来，因此会使用可被检测出的带有标记（如带荧光、放射性、化学发光或显色基团）的二抗与一抗结合。这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。
由于多个二抗可以与单个一抗结合（信号放大），二抗提高了检测的灵敏度。

直接检测：带有单个偶联物的抗体靶向结合感兴趣的目标
间接检测：使用不带偶联物的一抗以及带有偶联物的二抗

2.抗体的应用方法和技术

酶联免疫吸附实验  (ELISA)
ELISA的实验原理是基于抗体/抗原的特异性结合，它不仅能够对特定的蛋白进行定量分析，还可以研究分子之间的相互作用或其他特性。
将针对靶标的抗体与检测酶偶联。在加入底物时，这种酶催化底物生成有色产物。通过分光光度计的测定，便可以知道样品中抗原的浓度。
蛋白质印迹 (WB)
WB通常被用来确定样品间蛋白的相对表达水平，还可以确定目标蛋白的分子量大小，这有利于我们对蛋白的翻译后修饰过程进行研究。
加入未标记的第一抗体与抗原结合后，用酶/荧光团标记的二抗来检测一抗，染色显影后对目的蛋白进行分析。
WB的蛋白经过加热变性之后都变成线性的结构。因此最好的抗体是采用非常特异序列的人工合成多肽的方法来做实验，结果也非常特异。
免疫组织化学 (IHC)
IHC揭示了样本内抗原的组织特异性和亚细胞定位。相比与WB和ELISA，它的定量分析应用较少，但是在完整组织中对于蛋白表达的分析更有优势 。
IHC染色是通过抗体识别靶蛋白实现的。抗原抗体复合物能够通过酶促反应或者荧光来实现可视化。这些底物可以直接偶联到一抗或二抗上。
IHC实验中，最合适的抗体可以是纯化的重组蛋白得到的抗体，也可以是人工合成多肽得到的抗体（多肽是在蛋白质的表面）。
免疫细胞化学 (ICC)
ICC通常使用荧光标记的抗体来研究蛋白的亚细胞分布。与IHC相比，该技术提供了更高的空间分辨率，因为培养的细胞不会有组织样本的复杂环境。
在已经固定并通透处理的细胞培养样本中，抗体和靶蛋白特异性结合，再通过与一抗直接偶联的荧光素或荧光二抗，使其可视化。用荧光显微镜即可对结果信号进行观察。多个靶标可以使用不同荧光标记的一抗同时进行研究。
流式细胞术和细胞分选（FACS）
流式细胞术是测量细胞某些化学和物理特性的一种手段。参数测量包括细胞大小和细胞表面以及细胞内标记物的表达量。
流式细胞仪测量被标记抗体的荧光。细胞分选（FACS）是一种更复杂的系统，它能量化荧光信号，并将细胞以预先选定的特征（如荧光强度、大小和生存能力），从混合细胞群中分离出来。
流式细胞中分为两种，一种是活细胞的流式，这种流式最好采用是天然蛋白或者重组蛋白的抗体来做，另外一种是经过固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗体一致。
免疫沉淀 (IP)
免疫沉淀是分离纯化单一或复合蛋白的最常用的一种方式。染色质免疫沉淀(ChIP) 技术用来确定特定蛋白是否与体内特定DNA序列相互作用。
抗体被固定在固相基质（如磁珠/琼脂糖小球）上，从而从复杂溶液中捕获抗原。
IP的抗体最好使用纯化的天然蛋白制作的抗体来做，也可以用纯化的重组蛋白的抗体。最好不要用人工合成多肽制作的抗体，因为这种抗体识别的位点可能被深深地藏在了蛋白的内心深处。CHIP和IP没有太大的区别，唯一的问题在于，如果抗体识别的表位和该蛋白质与DNA结合的部位一致，则会导致CHIP实验的失败。
酶联免疫斑点 (ELISPOT)
ELISPOT用于检测如细胞因子和生长因子这样的分泌蛋白。该技术可以量化和对比各种刺激下的免疫反应。
在96孔板中，细胞生长在带有抗体包被的PVDF膜或硝化纤维素膜上，分泌蛋白会与抗体结合。抗体-抗原间的相互作用可以通过二抗进行检测，使得分泌蛋白的亲本细胞呈现特定的颜色（一个点=1个细胞）。对膜进行扫描和分析，以定量分泌蛋白的细胞的数量/百分比。
注意：通常用WB抗体稀释浓度为1:1000，IF/IHC为1:100，而如果可以做ELISA则可以稀释1:10000。如果一个抗体用来做ELISA的，那么言外之意就是该抗体效价不高。但不是说ELISA的抗体不能用于做WB，抗体说明书提示做ELISA稀释比例为1:1000，那么你可以试试1:100做做WB。
3.一抗&二抗选择指南

3.1 如何选择一抗

①根据实验类型选择抗体
确定实验类型，如WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，一般抗体说明书会列出该抗体经试验验证过，适用于何种分析类型，如未提及并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而是说明尚未经过此种分析试验验证（就不要尝试了）。如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
②根据样本种属选择抗体
如人、鼠、猪等，应选择物种相同或有交叉反应的抗体。
③选择抗体宿主物种
一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要。
1）产生一抗的生物体应与你的样品生物体不同。一般建议样本种属与抗体宿主物种的亲缘性越远越好，不宜同源。这是为了避免抗免疫球蛋白的二抗与样品中的内源性免疫球蛋白间发生交叉反应。例如，如果你研究小鼠蛋白，则应选择除小鼠以外的生物体产生的一抗。兔产生的一抗是合适的选择，然后可使用抗兔 IgG 二抗。
2）对于使用不包含内源性免疫球蛋白 (IgG) 的样品的技术，一抗宿主生物体的选择则不那么重要。例如，对预期不包含 IgG 的细胞裂解物进行的蛋白质印迹。然而，组织裂解物和组织培养物上清液（含血清）包含免疫球蛋白。对还原、变性样品进行蛋白质印迹时，IgG 会以 50 和 25 kDa 的条带显现，这两个条带分别对应于 IgG 分子的重链和轻链。
④分析目的蛋白的结构区域
分析了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，抗体说明书一般有相关免疫原的描述。若打算检测的是蛋白片段或是一种特殊的同型物又或是蛋白全长的某一区域，则必须选择用含有此片段域的免疫原制备的抗体。
⑤单克隆与多克隆的选择
在抗体抗原反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对较小，检测灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，但亲和力较强，检测灵敏度较高。
如果使用多克隆抗体发现有很多无法去除的非特异条带，建议换成单克隆抗体。
3.2 如何选择二抗

①种属来源
二抗（secondary antibody）能直接与靶抗原连接的一抗结合。根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
若一抗是鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗 (山羊抗小鼠或兔抗小鼠等)。
在特殊实验中，如双标实验，若一抗分别为兔源和鼠来源的，则相应的二抗应同时为抗兔和抗鼠，可选用驴来源的二抗。



②抗体亚型
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，相应二抗应为抗IgG抗体；单克隆抗体由于存在不同的类别和亚型，二抗选择时需要根据一抗类型或是亚类相匹配。
③完整片段还是抗体片段
二抗分为完整抗体和抗体片段两种，使用哪种需要根据实验来进行决定。主要有IgG分子完整抗体、Fab片段以及F(ab’)2片段。
较小的抗体片段能够更加高效地渗透组织，该特点对IHC及IF等实验应用特别有利；
采用抗体片段可减少抗体Fc部分与细胞上Fc受体之间的非特异性结合，这一点在分析Fc受体含量高的特定组织（例如脾）时非常有帮助。
④偶联标记物的选择
标记物与抗体偶联，以显示目标蛋白的存在。标记物的选择取决于实验应用。

• IHC、 WB和ELISA常用的二抗是酶标二抗；
  
• 细胞或组织的免疫荧光实验和流式细胞术中通常使用荧光染料偶联的二抗。
  

荧光标记物在特定波长的光激发下发出可见范围内的光，有多种荧光标记物可供选择，它们具有特有的激发和发射特性，常用的荧光染料包括FITC、PE、APC、DyLight™,AlexaFluor™或Atto染料。
酶标记物辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 在与适当的底物混合时形成有色沉淀，
亲和素及链霉亲和素能够与生物素结合并形成复合物，实现不依赖于二抗宿主种属的信号放大。HRP比AP更为经济和稳定，因此HRP在化学发光检测系统中更常用。不过，AP的灵敏度高于HRP，这使其在显色检测中更常用。


⑤抗体纯化
亲和纯化：大部分偶联二抗可通过亲和色谱法纯化。
预吸附：将含有二抗的溶液通过固定有血清蛋白（源自可能发生交叉反应的物种）的色谱柱填料。非特异性二抗将保留在色谱柱内，而具有高度特异性的二抗将流出色谱柱。
预吸附的二抗已经过附加纯化步骤，因此其特异性提高且交叉风险降低。
在使用吸附有源自亲缘关系较近物种抗体的二抗时，因为其表位识别能力已大幅下降并且可能对某些单抗的识别能力较差，选择时需更加谨慎。
4、内参抗体

4.1什么是内参抗体

所谓的内参抗体，我们可以从字面上来解释，就是内部参照抗体，它和目的抗体没有直接联系，而是一种精准制备抗体的辅助抗体。
比如我们需要对不同条件或不同组织细胞中表达的目的蛋白的相对多少进行比较，那么就需要有相同的定量，这样才会具备比较的基础。
但是在实验中，可能会因为蛋白浓度不太精准，或者在上样蛋白的时候，因为操作而产生偏差，这个时候，就需要有一款内部参照抗体来进行校正作用。这类抗体需要在冉细胞或组织间具备恒定的表达特性，而且表达量要高。这类抗体，我们称之为内参抗体。
内参抗体蛋白对于评估蛋白质免疫印迹法的效率和比较凝胶中每孔的蛋白上样量至关重要。此类对照可帮助确定样品间表达水平的差异是由细胞裂解物的实际蛋白水平导致，还是由上样量的差异导致。


DOI: 10.1186/s13046-016-0339-6
此外在WB实验中使用内参作为空白对照，还可以检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常、排除边界效应。
4.2 内参抗体的选择原则

没有一种内参蛋白适用于所有样本的Western Blot，要根据自己的样本选择合适的内参。
内参抗体种类有很多，根据蛋白的亚细胞定位，可以将其分为全细胞或胞浆内参、膜内参、核蛋白内参等，比如β-actin、β-tubulin、GAPDH、LaminB等。关于内参选择，我们一般遵循以下几大原则：
1、样本种属来源
①哺乳动物的组织/细胞样本，一般选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等内参。
②植物来源实验样本则可以选择Plant actin、Rubisco等内参。
③在研究跨物种的蛋白质时，选择具有适当跨物种反应性的上样内参。
④其他稀少物种来源研究较少，可以参照文献指导选择内参，或者是选择保守基因高表达的管家基因（GAPDH、Actin和Tubulin最常用的三个内参，它们在几乎所有的哺乳动物细胞中均有高表达，是最常用的胞浆或全细胞内参。）
2、目的蛋白分子量
目标蛋白和内参蛋白大小相当的话，WB 结果无法直接观察，很难进行准确数据的分析。因此要选择分子量与目的蛋白质差异较大的内参抗体，以确保两种蛋白质在检测过程中不会重叠。
一般应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上但不要差距太大。比如目的蛋白分子量为45 kDa，此时不适宜选择β-actin，可以考虑选择 GAPDH 或者β- tubulin。



https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html

3、目的蛋白表达部位
一般的蛋白质检测，GAPDH、β-Actin 或β-Tubulin 可以满足要求。
如果需要检测亚细胞器蛋白的时候，需要选择对应亚细胞器内参，这样更能体现内部参照的准确性。
核内参抗体有Lamin A、Lamin B、TBP、YY1、Histone-H3；
膜蛋白检测内参抗体有ATP1A1；
线粒体蛋白检测内参抗体有VDAC1和COXIV。


4、宿主
如果要进行多重免疫印迹（使用同时靶向目标蛋白和和内参抗体的一抗探针），则所选内参
抗体的宿主应不同于靶向目标蛋白的一抗宿主。
5、特殊实验条件
需要特别注意的是内参的选择还须考虑实际实验环境状况。在设计实验方案时应考虑这些因素的影响并查询相关文献，如果在实验过程中出现内参表达出现异常状况应及时分析原因并调整内参选择。
①如某些细胞或组织由于缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高，此种状况下GAPDH不适合做内参。
②研究结肠癌的发生及转移时，细胞骨架蛋白Vinculin不适合做全细胞的内参。近期研究表明，结肠癌中Vinculin表达的减少和增加与致癌和转移有关联。
③在细胞增殖相关实验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参。
④在凋亡实验中，TBP、Lamin等不适合作为核内参。
⑤做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参，比如Transferrin。
⑥在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用GAPDH作为内参，因为GAPDH作为代谢蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。
⑦检测磷酸化、乙酰化等修饰型蛋白时，要选择β-actin和β-Tubulin等结构蛋白作内参。
⑧在研究蛋白质翻译后修饰（PTM）时，使用未经修饰或完整的目标蛋白作为内参抗体，效果优于通用内参抗体。
4.3 常用的内参抗体

1、β-Actin
Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。
Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。
但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42KD左右。


2、Tubulin
Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。
Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin实际检测条带均在55kDa左右。
作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。


3、GAPDH
GAPDH即甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的一种关键酶，催化糖酵解的第六步，它还参与核转录等事件，核糖核酸转录、DNA复制和修复以及细胞凋亡。由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western Blotting的内参。请注意，某些生理因素，如缺氧和糖尿病，会增加GAPDH在特定的细胞和组织的表达。


其它内参

• Lamin B1（核纤层蛋白 B1），分子量约为66-72kDa，常用作核膜内参。
  
• Histone-H3（组蛋白 H3），分子量约为15-17 kDa，常用作核内参。
  
• ATP1A1（钠/钾离子转运ATP酶α1肽），分子量约为97-110 kDa，常用作膜内参。
  
• COX4I1（细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ亚型1），分子量约为17-20kDa，常用作线粒体内参。
  
• Transferrin（转铁蛋白），分子量约为77kDa，可作为全血/血浆/血清内参蛋白。
  

以上提到的并不是全部，还有很多靶标可以作为各种样本的内参蛋白。
总之，对于WB实验而言，没有内参作为参照，或者内参选择不合适，实验结果就会完全失去意义。针对不同目的蛋白，我们要依照其蛋白特性和实验条件差异化的选择最佳内参。
参考文献

1.https://www.thermofisher.cn/
2.https://www.abcam.cn/
3.https://mp.weixin.qq.com/s/dbpfIncmtZBhOEfTjDI97Q
4.https://www.sepmag.eu/blog/monoclonal-vs-polyclonal-antibodies
5.https://mp.weixin.qq.com/s/Bqxb3v3s-CK8veROUGvfjQ
6.DOI: 10.1186/s13046-016-0339-6

推荐内容

绝密！2023年国自然立项清单表可下载（生命科学部+医学科学部），附往年1000+份中标标书！
收藏好！国家自然科学基金的的摘要和结题报告下载方法！
有哪些好用的zotero插件?
最适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具？
科研人用的最好的三类科研作图软件汇总！
比科研者之家Figdraw更好用的免费在线绘图平台！
顶级图像分析软件，Image J、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定！
NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用？（附安装包）
2024年最新更新！EndNote X9（序列号激活），稳定，可汉化！
写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！
2024年持续更新！Zlibrary可访问链接
western blot是为了什么？分享实验室祖传的WB宝典
如何学习和记忆细胞信号通路？看完之后融会贯通
最值得推荐装！GraphPad Prism 9.3 ，功能更多！
SPSS 27 安装激活：授权到期时间2037年
流式数据分析标杆神器，FlowJo 10 分享！

最全的生物实验protocol与生物实验操作视频学习资料
112个科研软件免费版（数据处理+绘图+翻译+生物实验相关等）

• 下载链接：https://pan.quark.cn/s/34a75dd2
  

感恩由您

1. 什么是抗体？有哪些分类？


抗体 (Antibodies) 是由抗原进入机体，刺激 B 细胞增殖分化为浆细胞后合成并分泌的一类能与相应抗原发生特异性结合并产生免疫效应的球蛋白，又称免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)。抗体重链 Fc 区域的特异性序列决定了 Ig 的类型，如 α-IgA、δ-IgD、ε-IgE、γ-IgG、μ-IgM。轻链则有两种类型，分别为 λ 型和 κ 型 (图 1)。




图 1. 抗体结构 (左) 和检测原理 (右) 示意图


原理：抗体是一种特异性很高的蛋白质，可以识别和结合到特定的抗原上，从而形成抗原-抗体复合物。抗体检测利用这种特异性反应来检测体内是否存在特定的抗体。

2. 一抗二抗傻傻分不清楚？

2.1 一抗

作为萌新的你可能有疑问了：“抗体好像有两个？”
其实我们常说的抗体指的是第一抗体，即能和抗原特异性结合的蛋白，种类包括单克隆抗体 (monoclonal antibody，mAb) 和多克隆抗体 (polyclonal antibody, pAb)。前者可识别抗原上的单个表位，而后者能够特异性结合同一目标抗原上的不同结合位点 (图 2)。





图 2. mAb 和 pAb 示意图

单克隆抗体与多克隆抗体的区别




表 1. mAb 和 pAb 的主要区别


2.2 二抗

二抗是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。一抗可以特异地结合目标蛋白，但通常需要发光物质或者显色基团标记才能被检测出来，因此会使用可被检测出的带有标记（如带荧光、放射性、化学发光或显色基团）的二抗与一抗结合。这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。
3. 如何选择抗体？


看到这里，可能又有小伙伴迷惑了：抗体选择辣么多，而且各自都有看家本领，究竟谁才能让我的 paper 挤进上层社交圈，受到 Science，Cell，Nature 等业内大佬的赏识呢？
3.1 抗体选择之一抗

3.1.1 分析应用类型
根据所做实验类型选择抗体。
MCE 官网在产品页信息 “应用”一栏 列出了该抗体经实验验证后所适用的实验类型。
如，应用：WB, ICC, IF, IHC-P, FC。

3.1.2 分析样本种属

根据样本种属选择抗体。
MCE 官网在产品页信息 “反应性”一栏列出了该抗体经实验验证后所适用的种属信息。
如，反应性：Human, Mouse, Rat。

3.1.3 选择抗体宿主物种

一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要。
① 为避免抗免疫球蛋白的二抗与样品中的内源性免疫球蛋白间发生交叉反应，所选一抗的来源生物体应与样本中生物体不同。如，若研究小鼠蛋白，则应选择除小鼠外的生物体产生的一抗。假设选兔源的一抗，二抗则可选择偶联了检测分子 (酶、荧光素、生物素等) 的抗兔 IgG。
② 如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大。
MCE 官网在产品页信息“宿主”一栏列出了该抗体经实验验证后所适用的种属信息。
如，宿主：Rabbit。

3.1.4 分析目的蛋白的结构区域

① 待测样本蛋白区域：确认免疫原 (全长蛋白、蛋白质片段、多肽、整个生物体或细胞) 与待检测蛋白区域一致或包含在其内。
② 样本的提取或处理过程：有些抗体要求样品用特定方式处理，许多抗体仅能识别已还原和变性的蛋白质(其可暴露出蛋白质折叠形成的二级或三级结构中被隐藏的表位)；另一方面，有些抗体仅能识别天然、折叠状态的蛋白质上的表位。
3.2 抗体选择之二抗

3.2.1 一抗的种属来源

根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
① 若一抗是鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗 (山羊抗小鼠或兔抗小鼠等)。
② 在特殊实验中，如双标实验，若一抗分别为兔源和鼠来源的，则相应的二抗应同时为抗兔和抗鼠，可选用驴来源的二抗。

3.2.2 二抗的偶联标记

二抗的偶联标记类型主要有：
① 酶类标记（如 AP、HRP…）② 荧光标记（如 FITC、PE、Cy7…）③ 其他标记（如 Biotin…）
选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。
如：Western blot 和 ELISA，常用的二抗是酶标二抗；细胞或组织标记实验 (组织免疫化学，细胞免疫化学，流式细胞术) 中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。

抗体选择之内参选择完抗体，还要好好思考，该怎么选择内参。切忌不管什么样本，都千篇一律的选择“GAPDH”或者“β-Actin”。此外，选择内参时，还需要根据内参蛋白在样本中相应的表达量进行选择。给大家整理了一份内参选择的攻略，请及时收好哦~




表 2. 不同样本中内参选择参照标准

除表格外，还有一些小 Tips 要提醒大家喔~
1. β-Actin 不适用于心脏和骨骼肌的样品，心肌和骨骼肌样本可以用 α-Actin 做内参；
2. 当代谢信号通路受到影响，比如组织缺氧，糖尿病研究时 GAPDH 不适合做内参等；
3. 涉及细胞增殖时 PCNA 不适合做内参；
4. 涉及细胞凋亡时 TBP、Lamin 等不适合做内参;
5. Lamin B 不适合作为胚胎干细胞内参。  
4. 实验如何避雷？


4.1 你真的了解自己的蛋白吗？


你的蛋白是否容易发生修饰？是否容易产生聚合体？是否存在同工异构体？以及种属来源都会影响蛋白的分子量。这里，小 M 给大家推荐 “UniProt” 网站，只有了解蛋白的“前世今生”，这世的我们才能 “双向奔赴”，并“和平相处”呀。


4.2 你的样本真的完全裂解了吗？


这里， 建议选择合适的裂解液，如 RIPA Lysis Buffer (Strong)并通过匀浆或超声破碎的方式，充分使样本裂解。


4.3 你真的选择对的抗体吗？


科研汪们，切记选择已验证过并高特异性的抗体哦。我们提供的抗体都是具备严格，可控的质量标准哦。


4.4 你的实验操作真的无错可挑吗？


就实验操作给大家浅浅的提几条建议：注意配胶时充分混匀，关注电泳的条件。
1）选择合适的封闭液（HY-K1027），抗体稀释液，洗膜液（HY-K1022，HY-K1025）等。
2）配胶过程中，注意胶的状态。实验过程中，根据自己的目标蛋白，选择合适的电泳条件。
5. MCE 抗体（节选）

MCE 提供 900+ 一抗和多种二抗，涵盖热门靶点，助力您的科研成果 “通万路”！快来看看咱家的明星产品 (因出场位置受限，只邀请了 6 位明星代表)：

1）PI3 Kinase p55 gamma Rabbit pAb

应用：WB, IHC-P, ICC/IF反应物种：Human, Mouse, Rat





WB analysis of PI3 Kinase p55
gamma Rabbit pAb on different
lysates.
Lane 1-3:
HEK-293T, 3T3, C6 cell lysates.
2）Chk1 Rabbit pAb
应用：WB, ICC/IF, IP
反应物种：Human, Mouse, Rat





WB analysis of Chk1 Rabbit
pAb on different lysates.
Lane 1-3:
THP-1, C6, PC-12 cell lysates.
3）HDAC4 (4A3) Mouse mAb
应用：WB, IP, IHC-P
反应物种：Human, Mouse, Rat




IHC-P analysis of paraffin-
embedded human lung cancer
tissue using HDAC4 (A5)
Mouse mAb
4）ATP Citrate Lyase (3D9) Mouse mAb
应用：WB, ICC/IF, FC, IHC-P
反应物种：Human, Mouse,
Monkey






IHC-P analysis of paraffin-
embedded mouse testis tissue
using ATP Citrate Lyase (D7)
Mouse mAb.

5）JNK1 (1A4) Mouse mAb
应用：WB, ICC/IF
反应物种：Human, Mouse, Rat




IF analysis of JNK1 (A3)
Mouse  mAb in 3T3 cells
using JNK1 antibody.
6）Phospho-AMPK alpha 1 (Ser496) Rabbit pAb
应用：WB, IHC-P, ICC/IF
反应物种：Human, Mouse, Rat




IF analysis of Phospho-AMPK
alpha 1 (Ser496) Rabbit pAb
in Hela cells using AMPK
alpha 1 (Phospho-Ser487)
antibody.

小结
衷心祝福使用 MCE 抗体产品的科学汪都有机会得到 Science，Cell，Nature 等业内大佬的赏识，咱们下期再会哦！

相关产品
Phospho-AKT1 (Ser473) Rabbit MAb

可检测 AKT1 在丝氨酸 473 位点的磷酸化。AKT1 围绕 S473 区域与 AKT2 和AKT3 中的相应区域具有高度相似性，因此如果在相应的丝氨酸上磷酸化，可能会与这些蛋白质发生交叉反应。
alpha Tubulin Rabbit MAb

可检测 alpha-tubulin 总蛋白的内源水平，并不会与重组 β-tubulin 蛋白发生交叉反应。
Bcl2 Rabbit MAb

可检测 Bcl-2 总蛋白的内源水平。
Caspase 11 Rabbit MAb

可识别 Caspase-11 总蛋白的内源水平。
Cleaved-PARP1 Rabbit MAb

可检测由 caspase 裂解产生的 PARP1 大片段 (89 kDa) 的内源水平。该抗体不识别全长 PARP1 或其他 PARP 同工型。
HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)

在最佳条件下，将抗兔 IgG（H+L）片段与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，在 WB 实验中用作二抗。
Alexa Fluor® 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)

在最佳条件下，将抗鼠 IgG（H+L）片段与 Alexa Fluor® 488 偶联。

MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务