免疫荧光详细步骤

心中u你

今天做了免疫荧光实验。详细步骤来啦，有疑惑的地方欢迎询问哟。
实验步骤：

• -80度冰箱取出冷冻组织切片。
  
• 用4%的组织细胞固定液固定（甲醛）
  
• 1×PBS洗3次，每次5分钟（摇洗）
  
• 配置破膜液和封闭液。封闭液：0.25gBSA+5mLPBS（5%）破膜液：TritonX-100 混制：2uL Triton +1mL BSA (0.2%)。体积应根据用量决定，但要保证浓度值(0.2%)。
  
• 加入混制的破膜液和封闭液，室温封闭1小时。
  
• 甩干（可用纸轻拭周边）
  

• 以下步骤的体积比根据特定抗体的说明书进行。
  

• 1uL第一抗体+1mL5%BSA in PBS（即如上所述的封闭液）(1:1000)
  
• 冷库4℃过夜
  
• PBS清洗三次，每次5分钟。
  
• 孵二抗，如第7步，孵育1小时。（1:500）
  
• DAPI染色5分钟(细胞核染色)(DAPI : PBS＝1:500)
  
• PBS清洗1次
  
• 盖玻片封片
  
• 荧光显微镜下观察
  

DAPI会与细胞DNA结合，当DAPI与双股DNA结合时,在荧光显微镜观察下，DAPI染剂在358nm(紫外线)处有一个最大吸收峰，并在461nm(蓝)处有一个最大发射峰，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色，因此在荧光显微技术中DAPI被紫外线照亮且被蓝或青色滤镜检出。

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