技术剖析：液体活检之CTC篇

千姿百态

一．        液态活检


随着科技的发展，通过抽取少量血液来分析肿瘤信息的“液态活检”已经逐渐具有赶超和替代传统活检的趋势。
液态活检的来源包括CTC（循环肿瘤细胞）、ctDNA（循环肿瘤DNA）、microRNA（循环microRNA）、Exosome（外泌囊泡小体）等四种，前面两种目前在业界相对热门。本文将重点介绍液态活检之CTC的捕获与鉴定。


图1.液态活检。

二．        循环肿瘤细胞（CTC）


循环肿瘤细胞（CTC）被定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。目前CTC的应用主要在以下几个方面：
1)在常规手段无法对早期肿瘤进行判断时进行辅助诊断。
2) 在疗效评估方面，癌症患者进行化疗、靶向治疗后进行CTC 检测，若CTC 数量减少，提示治疗方式可能有效。相比于现阶段的检查手段，CTC 检测技术操作更方便，应用更简单，可以更及时地提示医生该患者是否适合化疗或靶向治疗。
3) 在术后监测方面，主要是由于活检无法高频次检测，而目前CTC 检测在术后监测中应用可能更方便，检测频次会更高。



图2.CTC在癌症治疗中的应用场景

三．        循环肿瘤细胞（CTC）的特性


1.        稀有性：每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞。
2.        非典型性的细胞形态：一般比血液细胞，正常组织细胞体积大；细胞核大，不规则，细胞核质比高；不易发生变形。
3.        异质性：细胞表面抗原标志物表达差异；携带不同的分子信息；转移潜力差异。
4.        不同形态和类别：CTC可以是间质型、上皮型或者上皮间质混合型，CTC也既可以是单个细胞的CTC也可以是成团的CTCs(CTM)。



图3.CTC的分类

四．        CTC的富集


人体循环系统中CTC的含量极低,肿瘤转移患者每毫升全血中仅有1～10 个CTC，因此要实现CTC的检测对其进行分选富集是一个必不可少的步骤。CTC分选富集效果的优劣将会直接影响其后续的检测(计数、基因扩增、基因测序等)效果,因此高纯度、高灵敏性(不丢失CTC)、快速、高细胞活性的CTC分选富集是CTC临床应用的重点和难点。



图4.CTC的检测流程图
CTC 的富集方法可以分为免疫亲和富集法和物理特性富集法。免疫亲和法主要是根据细胞表面表达的特异性的蛋白将CTC筛选出来，物理特性富集主要是根据CTC 的大小和密度等特性将这些细胞筛选出来。


图5.CTC的富集方法


图6.常用CTC富集技术比较

4.1免疫亲和捕获法

免疫捕获法的原理是将特异性抗原包被在已有同源抗体的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗原结合成“靶细胞—抗原抗体—磁珠”复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞。免疫捕获法又分为阳性富集，阴性富集和流式细胞术三种方法。

4.1.1阳性富集
使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。其中的典型代表是CellsearchTM系统，CTC芯片（CTCs-chip）和MACS®Cell Separation 磁性细胞分选系统。
原理：采用抗EpCAM结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTC。
优点：捕获的CTC纯度较高；能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTC。
缺点：无法捕获到间质型CTC（EpCAM阴性）。


图7.阳性富集—CTCs-Chip

4.1.2阴性富集
用特异性抗体CD45，CD14 等与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。典型代表是Cyttel/Cytelligen检测系统。
原理：利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，CTC被富集沉淀。
优点：可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTC。
缺点：样本处理步骤多，CTC易丢失。



图8.阴性富集法—Cyttel

4.1.3流式细胞术
原理：根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的CTC。
优点：可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析。
缺点：敏感性较低，需要的血液样本量大，缺乏规范的临床操作方法。

4.2物理特性富集法

4.2.1滤膜法
滤膜法根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC。其典型代表是滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISET）。
原理：将全血经过带小孔8um的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞富集得到CTC。
优点：分离后细胞完整性好；可完全分离上皮型、间质型CTC；可检出循环肿瘤拴子。
缺点：不宜检出细胞直径小于8um的肿瘤如神经内分泌瘤。

4.2.2密度梯度离心
密度梯度离心法是根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTC。其典型代表是OncoQuick分离体系。
原理：在密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTC被富集在介质层中，洗脱后得到CTC。
优点：可分离CK阳性和阴性细胞。
缺点：CTC迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失；CTC微栓子可能沉入红细胞层而丢失；与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关；用血量多，一般需要15-30ml血。



图9.密度梯度离心法

五．        CTC的分析与鉴定


利用免疫亲和或物理特性法可富集到CTC，接下来还需要结合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕获技术不能保证百分之百的纯度，需要对所得到的细胞进行鉴定，以进一步确定CTC细胞的数目，以减少CTC数目判定的假阳性率和假阴性率。另一方面，在肿瘤的发生发展过程中，不仅CTC的数目在动态的变化，CTC所携带的分子标志物也在变化，通过对CTC表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。常用的CTC检测技术如免疫荧光、PCR、FISH及高通量测序等。
1. 免疫荧光法（IF）: 实体肿瘤细胞一般均为上皮来源，细胞内会表达角蛋(cytokeratin, CK)或其他肿瘤标示物(如HER2)。借助免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC中的瘤标进行识别，从而达到检测CTC的目的。这也是目前检测CTC的最常见方法。缺点是，在CTC形成过程的间质化(EMT)阶段，大量的CK会降解，从而在CTC检测过程中出现假阴性。
2. 荧光原位杂交（FISH）: 荧光原位杂交，是根据已知细胞内特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与细胞内的基因组中DNA分子杂交，检测该特异基因序列的存在与丰度。FISH技术与CTC结合，不仅可以检测CTC表面标志物，也可以检测CTC细胞内部的标志物及核型等。
3. RT-PCR，反转录PCR: 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用引物和逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。结合RT-PCR可同时对若干个基因的表达进行检测。位点特异性PCR技术可用于检测CTC携带的驱动基因的突变情况。
4. 二代测序 : CTC数量少，直接进行二代测序难度大。需要将单细胞的DNA扩增后，再利用二代测序检查基因序列。但是，目前单细胞测序的技术仅仅停留在实验室阶段，未来向市场推广还有很长的路要走。而且由于肿瘤细胞的异质性，单细胞测序是否有代表性还需要更多的科学研究来证明。


图10.CTC检测技术比较

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