胶体金层析和荧光免疫层析的区别？

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如题，在某生物公司网站上看到的区别是说胶体金和荧光这两种方法在原理上一样，基本步骤稍有区别。是这样吗？做胶体金免疫层析的研究员转做荧光免疫层析会有很多困难吗？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/48434787

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在免疫领域，现阶段市面主流POCT以免疫荧光层析为主。通常免疫荧光较多采用荧光素作为标记物，荧光素是具有荧光特性的一类有机染料，然而，有机染料标记物光照下易分解，易发生光漂白现象，具有浓度猝灭特征，影响了分析结果的准确性和可靠性，因此寻求一种稳定高效，荧光寿命长，抗光漂白性强的荧光标记物显得尤为重要。
量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是近 20 年来发展起来的半导体纳米晶材料，是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm，存在显著的量子尺寸效应和表面效应，具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是在免疫生物学和临床检验学等研究中潜在的应用价值，引起了广大科学工作者的极大关注，近几年来已从细胞标记等应用逐渐向多个领域的检测与诊断方向渗透。
量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是纳米材料在生物分析领域的重要应用之一，目前国内许多体外诊断企业开始采用这一材料作为其荧光免疫层析平台的标记物。
与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点：

• 有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约25nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。
  
• 量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。
  
• 量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强，可以经受多次激发，且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。
  
• 生物相容性好，尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，可进行生物活体标记和检测，而传统的有机荧光染料一般毒性较大，生物相容性差。
  
• 荧光寿命长，典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns)，这与很多样本的自发荧光衰减的时间相当，量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns-50ns)，当光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景已经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号。
  

量子点荧光免疫层析技术利用量子点荧光探针做为标记物，不仅充分体现了免疫层析技术的简便，快速，特异性强的优点，而且展示了量子点的高灵敏度，以及它的荧光特性，显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景。
随着其应用越来越广泛，量子点免疫荧光层析技术也在不断地发展与改进，目前已实现了以下几个方面的改进：

• 优化了量子点荧光探针的制备，得到荧光强度高的QDs，检测信号会随着QDs的荧光增强而大大提高,可大大提高检测灵敏度，有利于信号的检测。
  
• 实现定量检测。目前荧光免疫平台均配套定量检测仪器，可以定量检测出待测物的浓度，打破了传统的胶体金免疫层析技术不能定量的限制，量子点免疫层析技术的应用，可大大提高定量检测的准确性和稳定性。
  
• 量子点的多色检测。QDs其中一个优点就是具有可精确调节的发射波长，可以通过调整粒子尺寸来得到不同发射的荧光QDs，无需改变粒子的组成和表面性质，使得量子点可以用于多种组分的多色标记，实现多组份的同时检测，这将比传统的胶体金免疫层析技术的多元检测体现出更大的优势，减少了不同抗体间的交叉反应，特异性更强，相互间不会产生干扰。
  

量子点荧光免疫层析技术现在一般采用量子点微球的方式，即通过物理或化学方法将量子点与高聚物材料掺杂的复合结构，粒径在纳米级至微米级范围，增大粒径，比单纯量子点有更高的荧光强度和稳定性。具体来讲，一般将量子点的表面引入极性的官能团如羧基等，使得量子点具备水溶性的同时又能带上与生物大分子链接的基团，再通过交联剂将量子点与生物大分子进行共价偶联或其他方式链接。

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技术原理上其实就是信号物不一样，其他都一样。标记上胶体金物理吸附，荧光微球共价结合，其实后者更可控。又因为荧光微球信号优势，所以后者替代前者。做技术的都觉得技术上区别不大可以相互胜任，但是当老板的有的太多有经验人员选择，他不会这么想。

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区别在以下几个方面
信号物的区别:胶体金层析的信号物是1-100nm直径范围里的纳米金颗粒，常用10-25nm，通常在520nm处有吸收峰，因此肉眼可见红色胶体银、胶体碳也可以归为这类吧；荧光层析的信号物顾名思义就是发荧光物质，给与适合的激发光就能发射出相应的荧光，不同的荧光显示出不同的颜色，荧光物质包括荧光蛋白、荧光化合物、荧光微球、量子点、上转发光等等。
原理的区别:胶体金与抗体通过静电吸附作用偶联；荧光物质与抗体的偶联则是根据荧光物质的性质来决定，常用的是化学偶联。所以制备步骤也不同，胶体金探针的制备步骤简单便捷许多，成本也低。
灵敏度:胶体金是可见光颜色信号，荧光是穿透光，因此荧光层析的灵敏度要比胶体金高起码一个数量级，而且制备胶体金的控制要求高，不稳定因素多，只能用于定性检测，荧光物质稳定性要更好，因此适合用于半定量检测，配合上检测仪能实现基本定量。
特异性:胶体金与抗体通过静电吸附，容易被样品中的基质影响，过酸过碱过盐都会影响，而荧光物质与抗体的化学偶联等较大程度抵抗基质的影响，因此在某些项目上荧光的特异性会更好些。
可用性的区别:因为荧光可以有不同波段的发射，显示出不同颜色，可用于多指标同时检测，大大拓展了试纸条的应用；胶体金就只有一种，就算标记不同抗体，相互间的影响很大，最多只能两三个指标同时检测。
最后，如果是做胶体金层析的工程师想转做荧光层析，应该是不难的，只要对整个研发过程有理解就很容易上手的。

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胶体金与抗体偶联一般是静电吸附，而一般荧光材料表面修饰有亲水基团如羧基或氨基，通过活化与抗体共价偶联。
两者的检测原理是一致的。但荧光法的检测灵敏度比胶体金要高，偶联时用的抗体量也会少一些，不过当前市场应用不多见。

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胶体金和蛋白的偶联是物理作用力，荧光免疫层析属于化学键偶联；虽然两个都属于层析的范畴，差别还是很大的；荧光偶联对个人的操作，工艺水平的要求更高一点。