立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索

图文播报

查看: 3685|回复: 0

[分享] 生化分析仪原理

[复制链接]
发表于 2024-9-6 18:28 | 显示全部楼层 |阅读模式

登陆有奖并可浏览互动!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

×
不同于血细胞分析仪测试血液中的有形成分血细胞(“什么是血常规 什么是三分类、五分类,为什么有了血细胞分析仪还要流式细胞仪?”),生化分析仪主要测试血液中的液体的血清/血浆(“IVD仪器检测的全血、血浆、血清是什么?”)中游离的物质。
如下图是一张典型的生化分析的检验报告。



以肝脏功能(肝功)项目中的丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)为例,在各种病毒性肝炎的急性期、药物中毒性肝细胞坏死时,ALT会大量释放入血液中,其在血液中浓度会明显增高,所以检测ALT在血液中的浓度,可反应肝功能是否受到损害。
其他物质在血液中的浓度,也都有相应的、不同的临床意义。
今天简单介绍一下生化分析仪的工作原理。
先来看一下生化分析仪原理的“简洁版”介绍。生化分析仪的理论基础是朗伯-比尔定律。即当一束平行的单色光垂直通过某一均匀的、非散射的吸光物质溶液时,其吸光度(A)与溶液液层厚度(b)和浓度(c)的乘积成正比。即:  



其中,
K:吸光系数,单位L/(g·cm)
A:吸光度,






那么想知道血清中某种物质X的浓度c,就把血清装在一个已知内腔宽度b的容器中(那么相应液层厚度b就知道了),然后用平行单色光照射,再测出入射光强度I0和透射光强度It,再想办法知道物质X的吸光系数K,就可计算出血清中物质X的浓度:



到这为止,“简洁版”的生化分析仪工作原理就结束了。
但我们来看一下这个“简洁版”的原理介绍,存在哪些问题。  
1.吸光度系数K从何而来?或者说仪器只能通过光电探测器(将光信号转换成电信号的传感器)测出光强度,怎样转换成物质浓度呢?
这就引入了定标或校准的概念。现在通过朗伯-比尔定律,可以知道浓度c和吸光度A之间是差了一个系数,那就想办法把它测试出来。这个过程就称为定标或校准。
基本的原理,就是用一系列的、已知浓度(C1、C2、C3……)的标准物质,在仪器上测试,得出其对应的吸光度值(A1、A2、A3……),然后拟合一条浓度值A和吸光度值C的关系曲线。被测物质的吸光度值Ax,代入拟合曲线,就能得到一个对应的浓度Cx。



许多物质的溶液显现出颜色,例如KMnO4溶液呈紫红色,邻二氮菲亚铁络合物的溶液呈红色等等,而且溶液颜色的深浅往往与物质的浓度有关,溶液浓度越大,颜色越深,而浓度越小,颜色越浅。历史上,人们用肉眼来观察溶液颜色的深浅来测定物质浓度,建立了“比色分析法”,即“目视比色法”。  
那么定标,就相当于肉眼观察时,有一张标准色卡,标准色卡写明了每种颜色所对应的浓度。目测溶液颜色,和标准色卡一对照,就能定量溶液物质浓度了。



但朗伯-比尔定律成立,需要很严格的前提条件,如下:
1.入射光为平行单色光且垂直照射;
2.吸光物质为均匀非散射体系;
3.吸光质点之间无相互作用;  
4.辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程,无荧光和光化学现象发生。
如果前提条件不符合,或者其他一些因素,标准曲会出现非线性的情况。如下面一些校准曲线。



那么就需要根据实际测试结果,进行校准曲线拟合。拟合之后,就能通过已知的吸光度Ax,在曲线上找到对应的样品浓度Cx了。
当然这里讲的定标或校准的概念,只是一个直观的理解。实际上牵涉到一些列的定标算法,也涉及校准品的制造等问题。由于篇幅原因,我们以后再讲。
吸光度系数K(或摩尔吸光系数ε),和物质种类、温度、入射光波长都有关系。为了保证校准曲线可用,就要控制前面几个参数。在一次测试中,物质种类是确定的,反应杯的温度就需要进行恒温控制,这就是生化分析仪中有温控系统的一个原因。而入射光波长就引出了我们下一个问题。
2.使用哪种波长的单色光照射被测物质?单色光如何实现?如何测量入射光强度I0和透射光强度It
不同的物质,对不同的波长的光的吸收度是不同的。
如下图重铬酸根对350nm的光,吸光度最高;而高锰酸根对525nm光吸光度最高。



而同一物质,不同浓度的溶液,最大吸光度发生的波长是一致的,曲线上是相似的。  



在物质的最大吸光度的波段,同一物质不同浓度的吸光度差异最明显,如上图中,高猛酸钾溶液在525nm波长的光下,吸光度差异最明显,不同浓度间的吸光曲线拉的最开。
那么为了获得更好的分辨率、更好的区分浓度差异,往往采用最大吸光度的波长的光,来照射物质溶液。这就决定了选择哪种波长的单色光来照射不同的物质。
那么单色光如何实现呢?单色光的生成,首先需要光源,生化上常用的光源就是卤素灯和氙灯。光源需要冷却,因为过高的温度会加速卤素灯泡的老化,从而缩短其使用寿命。所以光源同样要进行温控,这是生化分析一种需要温控系统的另一个原因。  
而光源是面光源,需要透镜组将光源的发出的光聚焦到比色杯中心这一点上,或者形成稳定的线光源。从而去接近朗伯-比尔定律中的平行光条件要求。同时光源中的红外部分的光,也需要过滤掉,避免造成比色皿的温升。
但光源出来的光,仍然是各个波长混合在一起的复合光。前面我们讲了,我们需要探测物质在特定某个单色光下的吸光度,而不是测复合光的吸光度。那就需要分光,分出某个波长的单色光。
分光一般分为前分光、后分光。
所谓前分光,就是把光源出来的光,在照射到比色皿上之前,就分离成单色光。一种典型的方式是,让复合光通过滤光片(只能通过特定波段的光,滤除其他波段的光),将光变成单色。
比如下面这个滤光片的只让625~675nm波长的光通过。注意滤光片透光率曲线中,纵坐标是透光率T,T=0时,代表这个波长的光无法透过镜片,就是滤光片对这个波长的光的吸光度A无穷大。T=100%时,代表这个波长的光可以完全透过镜片,也就是滤光片对这个波长的光的吸光度A是0。  









当然,绝对的某一个点波长的“单色光”,通过滤光片是很难实现的。  
通过滤光片得到的单色光束,首先照射分光镜上,分光镜可以让光50%透过,50%反射。反射的一半光被光电探测器(将光信号转化为电信号)进行光强检测,就得到了入射光强度参照

。透过的一半光照射并穿过比色皿,检测出的穿过比色皿之后的光强就是透射光强度

。从而能计算出吸光度A。



上图3 Filter wheel的结构如下,通过转动,而实现不同波长的光照射到比色皿上,以分析不同的物质。  





所谓后分光,是让光源出来的复合光,直接照射到比色皿上,然后将透过比色皿的光分离成单色光进行分析。所以前、后分光,是指在比色皿前还是后将光分成单色光进行分析。
后分光一种比较典型方案,是通过光栅将透过比色皿的复合光,分成不同波长的单色光,打到不同的光电探测器上,然后分析所关注的波长的光的强度,作为透射光强度

。而入射光强度

,则以空白对照所得的光强度为准。空白对照或空白调零,认为这种状态比色皿的吸光度A=0,或这种状态可依据吸光度的加合性(总吸光度等于吸收介质内各吸光物质吸光度的总和,A总=A1 +A2+A3+……),来消除比色皿对光的吸收和反射,除被测物质外的其他物质、溶剂、试剂对光的吸收等。  





  






后分光也有采用滤光片的方案,如下图。  





  



单色光是否可以用激光或者LED?当然可以,但是不同物质的主吸收光波长是不同的。激光器或LED可以产生单色,但一个激光器,只有一个波长。测不同物质需要不同波长,比如一些生化是12个波长、16个波长等,那就需要多个激光器或多个LED来测不同物质。激光器和LED这两种光源的价格都很高,尤其是激光器的价格非常昂贵。和100多块钱的卤素灯比,就没有优势了。
三棱镜也可以将复合光分解成各个波长的单色光。但三棱镜分出的光,均匀性不如光栅好,不利于光电二极管阵列的探测。  


  






声明
--文首注明来源的文章均为转载,仅用于学习分享,不代表微流控学习平台的立场,如涉及版权等问题,请尽快联系我们,我们第一时间更正,谢谢。
相关推荐

产品解析 | Abaxis Piccolo离心式生化盘片

离心微流控的应用之生化分析篇

便携式微流控生化分析系统研究的学习(Abaxis生化圆盘芯片)

更多精彩

微流控学习”公众号是一种共享学习平台,里面有原创的技术分享,科研信息,行业资料,产品资料等等,关注后可以通过微信App端的微流控学习公众号主页进行关键词检索,或者进入菜单栏选择话题学习,及时找到我们需要的信息或资料,亦是温故亦是学新。
你如果觉得文章还不错,请分享给更多的朋友
点击 “名片” 加关注,期待你的留言

原文地址:https://zhuanlan.zhihu.com/p/707559529
楼主热帖
回复

使用道具 举报

发表回复

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

本版积分规则

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

快速回复 返回列表 客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
快速回复返回顶部 返回列表