流式细胞术活细胞实验步骤

虎威将军

A. 溶液与试剂
注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。
1.1X 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS至 900 ml 水，然后将其混合。
2.抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 ，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA)来制备 0.5% BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
3.推荐的二抗：要检测未偶联的抗体，请选择与一抗（例如兔）的宿主物种匹配的二抗。
注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考所添加的染料产品页，了解建议的实验步骤。


B. 免疫染色
注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。注：如果使用全血，则需在免疫染色之前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。注：为防止人 Fc 受体与兔 IgG 或小鼠 Fc 受体与兔或小鼠 IgG 结合，在免疫染色前用 Fc 块预孵育活细胞。注：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。
1.将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用 5x10^5至 1x10^6 个细胞）。
2.通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3.在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4.在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
5.在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。如果使用直接偶联抗体，则跳到步骤 9。
6.在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
7.在冰上孵育 30 分钟。避光。
8.用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
9.在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。

注意细节，轻松搞定实验
1.仪器和试剂的选择。实验所用的荧光抗体的颜色，要针对已有仪器的检测通道。不能使用仪器无法检测的颜色。如果是多个抗体的染色，要根据抗原的表达水平来选择强度不同的荧光染料。基本原则就是表达越强的抗原所对应的荧光强度是越弱的那个荧光染料。还有就是尽量避免使用二抗，要使用已经标记好荧光染料的单克隆一抗来染细胞。在选择不同的颜色时，还最好要避开有光谱重叠较多的颜色。
2.每一个抗体在使用前都要做抗体浓度的优化滴定，计算染色指数，找到最佳工作浓度。
3.样本染色后要过滤（40-70微米的滤网），去除凝结的碎片和细胞团块，以防堵塞机器。
4.上机时，各个样本的细胞浓度要保持一致，所以要事先做细胞计数。
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