如何看懂文献里那些图——免疫组化(IHC)

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免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦如何才能染出了漂亮的片子，并分析出得出自己想要的结果呢？
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是应用免疫学基本原理——抗原抗体特异性反应原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。


作用：通过颜色来显示蛋白质的有无、定位（胞外、胞膜、胞浆、胞核）、含量变化
样本种类：
按来源：①组织；②培养细胞
按制作方式：①石蜡片（IHC-P）②冰冻片（IHC-F）③细胞片（ICC）


免疫组化具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等多种优点，可应用于确定细胞类型、发现微小转移灶、了解分化程度、肿瘤起源与分化 、指导治疗与预后等多个方面。
免疫组化实验流程通常包括样本固定、包埋、切片、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、酶底物显色或荧光检测、封片观察 9 个部分。这 9 个部分是环环相扣，每一步的疏忽都可能导致一无所获。



免疫组化（IHC）实验流程

那么染出来的免疫组化片子怎么进行分析放到文章中呢？
概括来说，免疫组化分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和染色强度评分法。前者是在光学显微镜下，随机多个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在下按染色强度和染色阳性范围评分，最终分数相加。
但组织样品的病理学分析仍然是耗时且主观的程序，其中人工判断染色强度来评分，直接受到视觉偏差的影响。且阳性细胞计数往往不能自动化进行，导致免疫组化分析费时费力。因此常借助软件进行客观分析，得到更加直观和稳定的数据。最常用的就是大名鼎鼎的Image J。
阳性着色细胞计数法就是通过Image J对片子进行颜色处理，转为非黑即白的二值化图片，进而进行自动化计数，得到结果。
染色强度评分法则是通过Image J将阳性细胞的平均灰度值（染色强度）和阳性面积百分比（染色面积）共同作为 IHC 测量指标，最终给出四种评分：High positive (3+),Positive (2+), Low Positive (1+) and Negative (0)。让我们来两张图看一下：



（Foxp3是Treg的主要调节因子，可用于鉴定Treg细胞；DAPI可与DNA强力结合，可用于观察阴性细胞）

那么这张图表达的意思就是，不同浓度的药物对肿瘤微环境中的Treg细胞的影响，可以看到背景深蓝色为DAPI染色的阴性细胞，天蓝色为标记的Treg细胞，通过药物作用，肿瘤微环境中Treg细胞数量不等，右面柱状图表明进行了定量分析，也是具有统计学意义的。


这张图中，vehicle为注射生理盐水的对照组，rGDF11为注射药物的实验组，粗略一看，我们可能不能明确的看出来两组的差异，但是通过染色强度定量分析，发现实验组的pSmad2/3、p-c-Fos、nfatc1着色显著多于对照组，具有统计学意义。
其实我们在很多文章中往往看不到统计分析图，这是因为我们做免疫组化的目的不一样，有的可能只是为了证明通过实验条件某种蛋白是不是表达了，或者说这种蛋白只在某种细胞中表达（比如肿瘤细胞），此时单列出免疫组化图片足以说明问题。
免疫组化（IHC）中存在的细节性问题“千千万”，每一种都有可能影响实验的成败，实验操作时应注意：

• 良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；接种的细胞密度适中以2×104/ml为宜，若密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片。
  
• 冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4℃冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
  
• 冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）。
  
• 加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜。
  
• Triton X-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
  

<hr/>  文章来源于江莱生物（shjianglai666）


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