手把手教学——Western Blot全流程实验步骤及常见问题详解

千姿百态

一、原理
蛋白质免疫印迹法即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

二、流程图：



(一)蛋白上清液提取：
a、准备工作：分装需要体积的蛋白裂解液（IP/RIPA），再分别加蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：PMSF 体积比为100:1），磷酸化蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制剂体积比为100:2）于蛋白裂解液中，加入Aprotinin 蛋白酶抑制剂，蛋白裂解液：Aprotinin（500×）体积比为 100:0.2；
b、剪取适量组织（尽量保证每一粒样品都剪去的一样多）和适量混匀的蛋白裂解液于匀浆器中磨匀（0.01g组织加上50-100ul的蛋白裂解液），直至看不见组织块；
c、转移匀浆液于 1.5ml 离心管中，置于冰上蛋白裂解10min；
d、提前开离心机预冷，4℃，12000rpm 离心 15min ；
e、将离心后的上清分装转移倒 1.5ml 新的离心管中，部分用于实验多余的存于-20℃；

若实验对象为细胞：悬浮细胞、贴壁细胞
悬浮细胞：
①收细胞：细胞悬液收集到离心管中，5000rpm，去上清，加1mlPBS，5000rpm，5min，加50ulIP/RIPA裂解液，冰上裂解20-30min；
②打蛋白：超声仪，探头使用前用纯水清洗，探头伸入液面以下，避免太多；设置程序：（打3s，停3s，共计92次）；破碎细胞后，4℃，12000rpm，10min离心，取上清（蛋白），蛋白置于冰上或放置-80℃。
注意：
①贴壁细胞：先用PBS缓冲液清洗两遍，然后加入蛋白裂解液（IP/RIPA），然后用细胞刮板将细胞+蛋白裂解液移至离心管中。
②一管细胞打20次左右，打蛋白的过程中会发热，可暂停置于冰上数秒。

BCA测蛋白浓度：（通常利用BCA试剂盒测定），基本流程如下：
96孔板：（一般最外围的孔不利用或加等体积的PBS溶液防止污染和蒸发）
（1）蛋白标准品BSA做标曲，取7个EP管，编号①-⑦
（2）浓度：①2、②1、③0.5、④0.25、⑤0.125、⑥0.0625、⑦0（单位：mg/ml）
（3）②-⑦+50ulPBS，①-②+50ulBSA
（4）②混匀，取50ul加③，依次加到⑥
（5）配样品浓度：45ulPBS+5ul样品浓度，配完短暂离心混匀（计算浓度时×10）
（6）配制工作液，配完避光，现配现用（A液：B液=50:1，一个孔要200ul工作液）：一个样要2个重复孔，计算体系：7个标准品+1个待测液溶液×2，共计16孔；防止加样误差，配置20个体系，一个200ul（20×200=4000ul/4ml）
（7）加样到96孔板：一个孔：20ul蛋白溶液+200ulBCA工作液；标准品从⑦-①加，两个平行孔一起加。
（8）37℃孵育30min（孔板底部勿触碰，保持完全干净）

• 测562nm处OD值，制作标准曲线（excel）
  

图1 37℃恒温箱孵育后，下一步酶标仪测定OD值2、蛋白液变性a 将上步蛋白上清液与 5×loading buffer 4:1 混匀，b 在沸水中煮 5min，水浴结束后，常温离心（瞬离），制胶后用于上样。
(二) 配胶1、制胶：浓缩胶/上层（5%）；分离胶/下层（根据蛋白分子大小而定）（1）制胶前用纯水检漏，加入纯水放置2-3min；（2）配制下层胶：试剂盒配置好的胶液靠边注入玻璃板（尽量不要产生气泡）；加入无水乙醇/双蒸水压平胶面，静置等胶凝固（根据天气室温变化，一般30min以上）；配制上层胶：下层胶凝固后倒掉无水乙醇/双蒸水，滤纸吸干，上层胶缓缓注入，插梳子，等待凝固（约1h）


图2 制胶完成后分离胶范围：



(三)电泳1、配制上样体系：蛋白溶液+5×loading buffer+PBS     蛋白上样量：20-50ug2、上样：最左和最右孔可加SDS-PAGE loading buffer压平条带；可与最中央或左右两端各加入3-5ul的蛋白maker；蛋白样品上样（9ul）




图3、4 上样，80v电压


图5 蛋白maker分离3、将胶置于电泳槽中，倒入电泳缓冲液，内部要漫过矮板，外部要漫过玻璃板底部；4、准备样品 maker 于冰盒上，顺序排好，上样，并在实验本上记录好；5、盖上电源盖，正负极相互对应，接通电源，恒压浓缩胶80V，30min或maker分离后可更改电压为120v，跑分离胶。待 loading buffer中的溴酚蓝跑至脚底部 1cm 处停止电泳。整个时间大概为 1.5h-2h。
(四) 转膜1、根据 maker 的指示，分别切出对应需要分子量蛋白的胶；并用尺子量取胶的宽度；2、准备6张与胶同样大小的滤纸和1张NC膜一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。使用PVDF膜需要用甲醇激活。3、按照3张滤纸，膜，胶，3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。将电泳夹轻轻夹紧，放入电泳仪中，要求胶靠近负极（电泳仪中的黑色一面）膜 靠近正极（电泳仪中红色一面），倒入电泳缓冲液没过有胶的地方。4、盖上电源盖，接通电源，转膜，不同的分子量转膜时间不同；（例如300mA，1h,20-25KD）注意：①黑面朝上，组装结构为：（黑）海绵—滤纸（2-3张）—胶—膜—滤纸（2-3张滤纸）—海绵（红or白）。如下图：


图6 “三明治”组装顺序②转模槽需埋入冰中，防止转膜过程中甲醇产热温度过高。



(五) 封闭配制 5%脱脂牛奶，质量体积比为1g脱脂奶粉：20ml 1×TBST 。将转完后的膜用 5%脱脂牛奶封闭至少1h。


裁膜孵育抗体：（注意：一些期刊杂志现在不允许裁膜）
(六) 一抗孵育1、配置抗体，稀释比例根据抗体说明书的要求配置，稀释液一般为一抗稀释液。孵育时间根据季节温度变化，夏天：4℃过夜，第二天室温摇床30~60min，直至抗体温度为室温；冬天：室温摇床 60min~180min，4℃过夜，第二天室温摇床60-120min，直至抗体恢复到室温。2、洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。
(七) 二抗孵育1、配置抗体，稀释液为 1×TBST，比例需根据说明书要求大概为 1:3000~1：4000。孵育时间为，夏天：室温摇床 30-60min；冬天：室温摇床 60min-180min。2、 洗膜 1×TBST 洗3次，5min一次。注意：一抗，二抗孵育洗膜时间可以灵活调整，一般3-5次，5min一次
(八) 显影曝光1、试剂盒A液+B液现配现用（A:B=1:1），避光保存；2、夹起膜放入玻璃皿中，吸显影液滴在膜上，确保显影液浸润到了膜所有地方；3、image Lab曝光步骤：膜放置皿中（小口径玻璃皿中）—打开仪器（image lab）,膜放入机器—选择印迹—colorimetic—自动曝光—拍白光圈4、曝光拍照（CHEMI）—选择“放置凝胶”——设置曝光时间（自动or手动）—凝胶成像—保存注意：一抗原液（1:1000）稀释，若显影条带较暗可适当提高比例如1:500Eg:5ul一抗原液+5000ul（5ml）一抗稀释液
注意事项1 、条带形状成弯状可能原因有：（1）跑胶电泳过程发热，电泳需要低温；（2）转膜电泳过程发热，转膜需要低温；转膜过程上下层滤纸接触，会导致局部短路，也散发热量。2、条带畸形最主要可能是胶没有混匀，转膜过程中胶与膜中间有气泡。条带拖尾，应该是蛋白杂质较多。3、 配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒或疙瘩，可能会导致在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。4、背景深（1）封闭问题，牛奶液体没有完全覆盖膜；（2）降低一抗浓度，孵育时间；（3）缩短二抗孵育时间；5 、没有条带首先利用丽春红对膜染色，若有条带在，就说明是转膜后面的封闭一抗二抗操作有问题，我们可通过调节后面的实验条件，重新对膜进行处理，最后还是没出不排除一抗有问题；若丽春红染色没有条带，则可以放弃此膜，转膜前面的步骤哪里出错，有可能蛋白浓度低或蛋白未提出。6 、曝光过后，若是β-actin 这样的内参很明显的降解成了两条带，则说明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巯基乙醇这类的还原剂失效。GAPDH内参不齐，可能是一抗使用多次，更换新的一抗，或者是上样量的问题。7、对于特殊的分子量如小于10KD，大于300KD 的蛋白，久未做出，可选择更改膜的品种，如 PVDF 膜，它亲和蛋白的能力大于NC膜，而且它根据膜的孔径半径分为几种型号（4.5um/0.22um），可选择适合的型号来转特殊分子量的蛋白，一般蛋白分子大于20KD选择使用0.45um，小于20KD选择0.22um孔径的。8 、配置30%SDS（聚丙烯酰胺）室温保存，也可直接用购买的SDS试剂。9 、APS（过硫酸铵）会失效，10%APS一般保质期才一个月左右，APS失效胶会不凝，要4℃避光保存。

参考资料：

• https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bmb.21516
  
• https://histogene.co/western-3/
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/657205089