分子诊断的“后起之秀”——等温扩增

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PCR 是核酸检测的革命性分水岭，自 1983 年出现 PCR 技术以来，以其灵敏度高、特异性强和稳定性好已渗透到生命科学的各个领域。 近年来，由于 PCR 技术的不断成熟，特别是实时 qPCR 的出现，使得分子诊断日渐成为主流。     
PCR 技术利用耐高温的 DNA 聚合酶，经过“高温变性-低温退火-引物延伸”3 个步骤，使特异性 DNA 片段呈指数性扩增。因此，PCR 反应至少需要经过 2 个不同的温度进行热循环才能实现扩增，依赖于复杂的温控设备即 PCR 仪，使得 PCR 的应用被限制在实验室的范围内。
随着分子诊断技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法广泛应用于疾病检测，即时检测（POCT）有利于预防和控制传染病，等温扩增技术应运而生。等温扩增技术是在 PCR 的基础上发展起来，具有简单、快速、高效等优点，反应条件温和，不需要复杂的温控设备，降低了对实验环境和硬件条件的要求，在 POCT 的发展中具有广阔的前景。等温扩增在分子诊断中可能作为 PCR 的替代检测技术。
等温扩增

等温扩增技术（lsothermal Amplification Technology）是一类分子生物学技术的统称，可在某一特定温度下，扩大特定 DNA 或 RNA 片段的拷贝数。等温扩增是利用不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）在等温条件下快速扩增核酸，不需要进行高温变性、退火等步骤，只需要加入相应的引物、模板和酶进行反应。
PCR 需要经过高温变性打开双链，反复改变反应温度会影响酶及各种试剂的作用，而等温扩增技术在单一温度下进行扩增，利用具有链置换活性的 DNA 聚合酶，在沿着双链 DNA 移动时“解开”链。
等温扩增的类型 [1]

等温扩增技术发展迅速，基于等温扩增研发出了一系列新型核酸扩增技术，因其所用酶的多样性和引物设计不同，其扩增原理也千差万别。
根据扩增的目标不同可分为目标放大和信号放大，目标放大是通过增加目标序列拷贝数来达到检测目的，信号放大是通过检测目标序列后对获得信号进行放大来达到检测目的 [2]。根据扩增产物的类型不同可分为“DNA 扩增”和“RNA 扩增”。目前的等温扩增主要以目标放大和 DNA 扩增为主。


PCR vs qPCR vs等温扩增

反应过程中温度是否变化，是等温扩增和 PCR 扩增之间的主要区别。
与PCR技术相比，等温扩增缩短了核酸扩增的时间，降低了对温控仪器的依赖性，同时降低了成本，在基层推广和现场检测中具有非常好的应用前景。
等温扩增技术与qPCR技术有着很强的技术互补性 [3]。qPCR的优势在于可在实验室中进行高通量检测，而等温扩增技术更有利于即时的现场快速检测。


等温扩增的应用 [4-5]

等温扩增是在等温条件下的核酸扩增和检测技术，无需热循环仪，实验操作简单，能在短时间内完成培训，特别适合在一些经济欠发达地区，检测设备和检测条件欠缺的情况下，进行现场检测和即时诊断。
等温扩增技术具有快速、灵敏、稳定等特点，应用于医疗、生物工程和生物物质检测等不同领域，对于促进生物医学和生物工程技术的发展有重要意义。
1. 医学诊断
等温扩增技术可用于医学诊断领域，辅助诊断和治疗。例如，针对危害公众健康的呼吸道传染性病原，肠道致病病原及生殖系统病原进行快速检测，现已逐步用于包括 DNA 病毒、RNA 病毒、细菌和寄生虫等的定性和定量检测。
2. 生物工程
等温扩增技术可用于检测和筛选新的基因，进行 DNA 合成和基因编辑。例如，可使用等温扩增技术扩增和检测工业微生物中的特定基因，进行编辑和修饰；也可用于转基因食品的检测及动物胚胎性别鉴别等。
3. 生物物质检测
等温扩增技术可用于生物物质检测领域。例如，在食品安全领域，可针对致病微生物、动物源性成分和转基因农产品进行快速检测；在水质检测领域，可以帮助快速检测水中的大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等细菌。
等温扩增的局限性

虽然等温扩增技术在检测速度、仪器小型化、可视化判读结果等方面与 PCR 技术相比有一定优势，弥补了传统 PCR 检测技术设备依赖和检测周期长的不足，但等温扩增技术在分子诊断中仍不能完全替代 PCR 技术。
依然存在一些局限性，使得现场检测难以实现。
1. 样品前处理成为主要制约因素。目前一些等温扩增技术对模板纯度要求较高，核酸提取步骤依赖于实验室操作。
2. 难以实现多重检测或多靶标等温扩增检测，并同时具有扩增速度快、高灵敏度和特异性。
3. 检测通量低，不能进行高通量检测，容易产生假阳性结果。
总之，以等温核酸扩增技术为基础的诊断仪器和试剂盒的开发和应用会是分子诊断未来发展的方向，实际应用过程中还可以采取组合检测方式，等温扩增技术用于初筛，PCR 技术用于复核，可以充分发挥两种技术的优势和特点，满足现场快速检测的实际需求。
参考文献：

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