滴滴滴！巨噬细胞变形记：激活和分化指南 |MedChemExpress (MCE)

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巨噬细胞——免疫系统的重要成员！  巨噬细胞在各种疾病中充当了怎样的角色？我们又怎么在实验室中诱导巨噬细胞并将其进一步分化为不同的亚型呢？ 让我们一起来学习一下吧~




01
巨噬细胞：功能和作用机制

巨噬细胞，一种白细胞，其生命旅程开始于骨髓，在分化形成巨噬细胞后被释放到血液中，随着血液循环进入各个组织中，并分化成不同的类型，例如大脑中的小胶质细胞和肝脏的 Kupffer 细胞。

巨噬细胞的主要功能是吞噬细菌、病毒等病原体，也可以消灭生物体内的肿瘤细胞和死亡细胞，在生物体中发挥“清道夫”的作用。巨噬细胞还可以通过呈递抗原，分泌趋化因子和细胞因子的方式参与免疫反应，激活其他免疫细胞。此外，巨噬细胞参与组织修复，在移植器官的存活和排异中发挥作用[1]。

但巨噬细胞也可能成为疾病的帮凶，促进肿瘤生长和转移，维持病原体在体内的存在，或导至组织损伤和炎症反应。

图1. 巨噬细胞吞噬细菌的过程。

①.巨噬细胞可以识别外来细菌，向其移动并吞噬细菌。②.在细菌周围形成吞噬体，通过与溶酶体融合的方式使其释放吞噬酶。③.细菌被吞噬酶消化，未被消化的细菌残体通过胞吐作用被排出体外。

巨噬细胞可根据微环境进一步极化为经典激活型 1 (M1) 和替代激活型 2 (M2)。M1 巨噬细胞由促炎因子如 IFN-γ、 TNF-α、LPS 和 GM-CSF 激活产生，分泌促炎细胞因子和一氧化氮以及活性氧 (ROS)，促进炎症反应对对抗病原体感染。M2 型巨噬细胞由抗炎因子产生，有助于组织修复、免疫调节和纤维化[1][2]。

图 2. M1 型和 M2 型巨噬细胞[2]。

巨噬细胞可以大致分为 M1 和 M2 两种亚型，M2 可以进一步分为 M2a，M2b，M2c 和 M2d 四种表型。M1 对抗病原体感染，诱导促炎反应。M2 促进抗炎反应和肿瘤发展。另外，M2a 主要介导组织修复；M2b 负责免疫调节；M2c 在吞噬作用中起作用，M2d 参与肿瘤的血管生成。

02
巨噬细胞：如何诱导分化？

在实验室中通常从外周血单核细胞 (PBMCs) 或人急性单核白血病细胞 THP-1 开始，通过加入特定的分化因子，诱导它们分化为成熟的巨噬细胞。

一、从外周血液诱导巨噬细胞分化

外周血单核细胞可以从血样中通过密度梯度离心法获得。

• 将新鲜的抗凝血液样品与平衡密度梯度介质(Ficoll-Hypaque-1077 或 Lymphoprep) 混合。
  
• 通过低速离心 (400 ×g，30 min) 使不同密度的细胞组分在离心管中形成分层。PBMCs 处于血浆和红细胞之间的不透明中间层。
• 吸取中层细胞悬液并重复洗涤 (PBS，4°C，250 ×g，10 min) 直至获得澄清的上清液[3]。
• 
  
  

图 3. 从血样中分离外周血单核细胞 (PBMCs)[4]。

分离得到外周血单核细胞后，我们可以从中提取得到人单核细胞，并通过添加生长因子进而诱导其向巨噬细胞分化。同时，我们也可以直接诱导 PBMCs 分化形成巨噬细胞。具体流程如图 4 所示。

图 4. 从外周血液诱导巨噬细胞分化[3]。

具体步骤 (供参考)[3]：

(1) 将分离得到的 PBMCs 加入含有 15% FCS 的 10 mL RPMI 1640 (含有 penicillin，streptomycin 和 2 mM glutamine)。计数并将细胞浓度调节至 1×107 cells/mL。
(2) 将 10 mL 细胞悬浮液加入培养皿中。不要去除不贴壁的细胞。
(3) 在 37°C 下用 5% CO2 的加湿培养箱孵育细胞。在 2 天和 4 天后更换新鲜的 RPMI/15% FCS 培养基。
(4) 细胞在第 6 天时已经分化为巨噬细胞，并且牢固地贴壁生长。
(5) 取出培养皿并加入 10 mL 冷 PBS，并且置于冰上 30 min。使用细胞刮刀，轻轻地将细胞从板上刮下。
(6) 将细胞以 250 ×g 离心 5 min，并重悬于 RPMI/5% FCS 中并铺板。
(7) 用新鲜的添加有 10% FCS 的 RMPI 1640 更换培养基。
(8) 加入 10 ng/mL LPS 和 5 U/mL 人重组 IFN-γ (可诱导 M1 极化) 或加入 20 ng/mL 人重组 IL-4 (可诱导 M2 极化)，在 37°C，5% CO2 下孵育 24 h。
(9) 去除上清液并更换培养基 (新鲜的添加有 5% FCS 的RMPI 1640)。




  注意事项[3]:

• 选取不超过 8 小时的血样，实验效果最佳。
  
• 单核细胞将在大约 1 小时内附着在板上。在这段时间之后，他们将自发地分离。如果要在小板 (例如 6 孔板或 24 孔板) 中分化细胞，则在用温 PBS 洗涤细胞后，加入 10 mL RPMI1640/FCS 10%，并在 37°C 和 5% CO2下孵育过夜。在这段时间之后，单核细胞漂浮在上清液中。用细胞刮刀分离贴壁生长的细胞，以 250 ×g 在 4°C 下离心 5 min，对细胞进行计数，铺板。
  
• 人血清可以从不同的公司获得。如果您从献血者处获得血清，请制作一个不同供体的池，以避免分化细胞之间的差异。使用前，在 56°C 的水浴中加热 30 min。
  
• 仅向一个方向移动细胞刮刀。在几个方向上移动可能会降低细胞活力。
  
  

二、用 THP-1 细胞诱导巨噬细胞分化

除了从人血样中分离单核细胞进而分化得到巨噬细胞外，也可以直接诱导 THP-1 细胞分化，步骤如下[5][6]。

▐  细胞培养

(1) THP-1 细胞在含有 10% FBS 、2×10-3 M, L-Glutamine、1% 抗生素-抗真菌溶液和 50 × 10-6 M, 2-mercaptoethanol 的 RPMI 1640 培养基中培养。
(2) 在 37°C 下用 5% CO2 的加湿培养箱孵育细胞。
(3) THP-1 为悬浮细胞，倾向于高密度生长，需要偏高的密度维持较好的细胞状态，一般 1:2 半换液或者补液来传代，少离心，尽量使用高质量血清。

▐  诱导巨噬细胞分化

(1) 将 THP-1 细胞接种在孔板中 (密度为 5 × 105cells/mL)，加入 PMA (浓度为 50-200 ng/mL)，处理细胞 24 h 以诱导分化。

图 5. PMA (HY-18739) (100, 200 ng/mL) 诱导 THP-1 细胞贴壁和分化。

PMA 处理 24 h 后细胞由悬浮生长变为贴壁生长，高倍镜下可看到部分细胞的胞浆里含有大量颗粒状物质，同于之前的透亮状态; 可观察到细胞变得更扁平，呈不规则形，部分细胞有伪足伸出，贴壁呈阿米巴样生长。(已经过 MCE 生物实验验证)。

▐  巨噬细胞极化

(1) M0 静息巨噬细胞的极化

在用 PMA 处理细胞 24 h 后，用无血清培养基洗涤分化的贴壁细胞两次，然后在无 PMA 的培养基中静置 24 h，以获得 M0 静息巨噬细胞。

(2) M1 经典激活巨噬细胞的极化

在用 PMA 处理细胞 24 h 后，用 100 ng/mL LPS 和 20 ng/mL IFN-γ 共培养细胞 24 h，以获得经典激活的 M1 型巨噬细胞。

(3) M2 替代激活巨噬细胞的极化

在用 PMA 处理细胞 24 h 后，用 20 ng/mL IL-4 和 20 ng/mL IL-13 共培养细胞 24 h，以获得替代激活的 M2 型巨噬细胞。

03
M1/M2 型巨噬细胞的鉴定

一、形态学差异

• M1 型巨噬细胞：较为扁平，细胞分布分散，伴有较多的假伪足。这些特点有助于它们识别和吞噬病原体。此外，M1 型巨噬细胞的细胞质内含有大量溶酶体和消化酶，以便分解入侵的病原体[6]。
• M2 型巨噬细胞：多为圆形体，细胞表面的突起较少。M2 型巨噬细胞的细胞质内含有更多的吞噬体和细胞器，这些结构参与清除死亡细胞和促进组织再生[6]。
  
  

图 6. M1 型和 M2 型巨噬细胞的形态学特征[6]。

A. 巨噬细胞在 LPS/IFN-γ 以及 IL4/IL13 的作用下极化为 M1 和 M2 亚型，以及其在光学显微镜下的形态特征。B. 左图：M0/M1/M2 型巨噬细胞在细胞厚度和坚固度方面的形态描述。右图：M0/M1/M2 型巨噬细胞在电子显微镜下的细胞核 (蓝) 和肌动蛋白 (绿) 特征。

二、表面标志物

• M1 分泌产生促炎性细胞因子，如 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-12，以及高水平的活性氧 (ROS) 和氮物质。
• M2 分泌抗炎性细胞因子，如 IL-10、CCL18 和 CCL22。M2 型巨噬细胞还表达几种受体，如甘露糖受体 CD206 (或 MRC1)、清除受体 CD163、dectin-1 和 DC-SIGN[3][7]。
  
  

表 1. M1 和 M2 型巨噬细胞分泌的表面标志物[3][7]。

04
小结

通过本文的介绍，我们不仅学习了巨噬细胞在不同疾病下的功能变化，而且深入探讨了其从单核细胞到成熟分化细胞的“升级之路”。巨噬细胞的分化和极化在疾病治疗中具有重要的意义，随着研究的进一步深入，我们也将揭开巨噬细胞的神秘面纱，为多种疾病=治疗开发出新的靶点。
参考文献：
[1] Strizova Z, et al., M1/M2 macrophages and their overlaps - myth or reality? Clin Sci (Lond). 2023 Aug 14;137(15):1067-1093.
[2] Wang Y, et al., Macrophage-derived extracellular vesicles: diverse mediators of pathology and therapeutics in multiple diseases. Cell Death Dis. 2020 Oct 28;11(10):924.
[3] Rios FJ, et al., Isolation and Differentiation of Human Macrophages. Methods Mol Biol. 2017;1527:311-320.
[4] Patrone D, et al., Optimization of Peripheral Blood Mononuclear Cell Extraction from Small Volume of Blood Samples: Potential Implications for Children-Related Diseases. Methods Protoc. 2022 Feb 24;5(2):20.
[5] Xing S, et al., Changes in macrophage morphology and prolonged cell viability following exposure to polyethylene particulate in vitro. Microsc Res Tech. 2002 Jun 15;57(6):523-9.
[6] Rios de la Rosa JM, et al., The CD44-Mediated Uptake of Hyaluronic Acid-Based Carriers in Macrophages. Adv Healthc Mater. 2017 Feb;6(4).
[7] Genin M, et al., M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 2015 Aug 8;15:577.