免疫荧光直接和间接的区别及注意事项

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一、直接免疫荧光法的操作步骤
标本的处理：
石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01MPBST漂洗5min × 3/次；
•2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min
•抗体染色：
–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37°C孵育30min；
•0.0lmol/L PBS(pH 7.4)漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片
–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。

直接免疫荧光法的注意事项：
•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；
•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；
–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；
–染色温度：多采用室温(25°C)，高于37°C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2°C的低温，延长染色时间。–低温染色过夜较37 °C 30 min效果好的多。
•试验时需设置下列对照：
–自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；
•经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。2间接法又称为荧光抗-抗体法j 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。

二、间接法又称为荧光抗-抗体法
需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。间接免疫荧光法操作步骤
•标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
•一抗染色：
–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37°C作用30min或4°C过夜。
•0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；
•加荧光标记的二抗抗体，37°C湿盒避光作用30min。
•0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；
•甘油缓冲液封片
•镜检
•优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；
•缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。

间接免疫荧光法的注意事项：
•荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
•每次试验时 ，需设置以下三种对照：
–阳性对照：阳性血清+荧光标记物
–阴性对照：阴性血清+荧光标记物
–荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
•标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
•一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

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